蛋白質芯片檢測技術結合多維統計方法推斷死亡時間

張旭東，姜垚如，梁芯瑞，田甜，靳茜茜，張小紅，曹潔，杜秋香，孫俊紅

1.山西醫科大學法醫學院，山西 晉中 030600；2.禹州市公安局，河南 禹州 452570；3.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川 成都 610041；4.鄒平市公安局，山東 鄒平 256200

準確推斷死亡時間（postmortem interval，PMI）是法醫學實踐中的一個關鍵問題，死后相關生物技術分析可為其提供重要、可靠的數據。法醫昆蟲學[1]或形態學[2]分析可為死亡時間推斷提供基礎依據，但因易受外界復雜環境的影響，存在一定的局限性和不穩定性。

隨著生物技術的發展，研究者們愈發關注生物大分子如RNA[3-4]、DNA[5-6]或蛋白質[7-8]的死后變化。近年來，機體死后骨骼肌蛋白質降解的相關研究取得了重大進展。在標準化動物模型中，可通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western 印跡分析，發現如蛋白磷酸酶2A、結蛋白、肌鈣蛋白[7-8]等特定蛋白質的降解模式。此外，死后變化如天然蛋白條帶的丟失或特定降解產物的出現，與死亡時間顯著相關[9]。

利用蛋白質芯片毛細管電泳進行蛋白質分離，具有快速、準確、靈敏等優勢[10]。2100 生物分析儀（美國Agilent 公司）集成多個實驗程序，包括樣品處理、分離染色、脫色、檢測和分析，在其基礎上結合蛋白質芯片，可分析多種蛋白質樣品。目前，蛋白質表達譜的應用主要集中在臨床疾病檢驗、藥物研制及物種鑒定等領域[11]。

本研究收集死后不同時間點大鼠骨骼肌及人體骨骼肌樣本，采用蛋白質芯片檢測技術獲取死后蛋白質表達譜，通過多維統計方法，探索蛋白質含量變化與死亡時間的關系，建立死亡時間預測模型，為死亡時間推斷提供新的思路和技術支持。

1 材料與方法

1.1 樣本制備

健康成年雄性SD 大鼠8 只，10～12 周齡，體質量200～230 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。溫室飼養2 d，腹腔注射20%烏拉坦（1 g/kg，北京索萊寶科技有限公司）麻醉后頸椎脫臼處死，死后放入16 ℃人工氣候箱。于死后0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d 和9 d 分別取每只大鼠右后肢腓腸肌（200±2）mg，重復收集大鼠的肌肉組織樣本，每次收集后保持皮膚覆蓋，共收集80份樣本。樣本于液氮速凍后放入-80 ℃冰箱待檢。

收集2021 年山西醫科大學司法鑒定中心9 例不同死亡時間人體骨骼肌樣本，按序編為1～9 號，其中3 例經冷藏（計算死亡時間時除去尸體冷藏時間），樣本信息詳見表1。樣本均為無損傷、無出血的胸大肌，每份肌肉組織為（200±2）mg，于液氮速凍后放入-80 ℃冰箱待檢。

表1 9 例人體樣本的詳細信息Tab.1 Details of 9 human cadaver samples

本研究已獲得山西醫科大學科學研究倫理審查委員會批準（審批文號：2020LL149）。

1.2 蛋白質提取

將大鼠和人體的骨骼肌在液氮中研磨至粉末狀后置入微量離心管，同時將蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF；武漢博士德生物工程有限公司）與純水按1∶3.5的質量濃度比（kg/L）加入離心管，冰上孵育1 h，以12 000×g離心20 min，吸取上清液400 μL 分裝備用。

從每只大鼠10 個時間點的蛋白上清液中各取50 μL，混勻制成400 μL 的質量控制（quality control，QC）樣本，共8 份。

1.3 蛋白質芯片樣本制備及檢測

根據蛋白質230 試劑盒（美國Agilent 公司）說明書在4 μL 樣本中加入2 μL 變性劑，將樣本溶液和Ladder 置入100 ℃水浴中加熱5 min，再加入84 μL 去離子水進一步稀釋，從稀釋液中取6 μL 加載到蛋白質芯片相應的孔道中。

每個芯片加載10 個樣本，然后將芯片置于2100生物分析儀中進行分析，20～30 min 后，獲取每個樣本相對分子質量為14 000～230 000 的水溶性蛋白質表達譜數據。

1.4 數據預處理

采用2100 Expert 軟件（美國Agilent 公司）獲取大鼠和人體骨骼肌蛋白質凝膠電泳圖和電泳色譜圖。根據內標“lower marker”和“upper marker”對電泳色譜進行定標識別，并對峰位進行校正調整。為消除雜質干擾，去除熒光強度在10 FU 以下的峰[12]。將遷移時間（相對分子質量大?。┗疽恢碌姆逵洖橄嗤幪?，對峰含量進行歸一化處理。

1.5 統計分析

使用SPSS 22.0 軟件（美國IBM 公司）對8 份QC樣本進行單因素方差分析，檢驗組間是否存在差異；再行多重比較最小顯著性差異（least significant difference，LSD）檢驗，分析QC 樣本是否存在差異。采用SIMCA 14.1 軟件（瑞典Umetrics 公司）對死后各時間點大鼠骨骼肌樣本的峰高數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）降維，結合正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）判別分析死后各時間點之間的差異，其中R2、Q2表示模型的解釋能力和預測能力，R2、Q2終點越接近，同時Q2回歸直線與Y軸有負截距，說明模型有效，無過度擬合現象。R2X、R2Y分別為模型對自變量X、因變量Y的解釋能力。當Q2＞0.5 且與R2Y差值不超過±0.3 時，認為模型有效、數據可靠[13]，用基于交互驗證的方差分析（cross validation-analysis of variance，CV-ANOVA）檢驗死后不同時間點樣本間的差異。采用SPSS Clementine 12.0 軟件（美國IBM 公司）分別建立Fisher 判別模型和反向傳播（back propagation，BP）神經網絡模型，對死后不同時間點大鼠骨骼肌樣本進行分類預測，隨機選取70%的數據作為訓練集、30%的數據作為測試集，分別獲取兩個模型的內部交叉驗證準確率及外部驗證準確率，同時以混淆矩陣總結BP模型的預測能力。使用Morpheus分析軟件（https://clue.io/morpheus/）對人體骨骼肌蛋白質中各峰的含量進行熱圖及聚類分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠骨骼肌蛋白質表達譜峰分析及模型建立

2.1.1 大鼠骨骼肌蛋白質譜峰特征及差異性

QC 樣本的單因素方差分析及多重比較結果表明，組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

死后不同時間點蛋白質的譜峰形狀相近，多數峰位置一致但峰高不同（圖1A～B）；凝膠電泳圖中各條帶隨死亡時間的延長有所變化（圖1C），在保留時間24 s 時，死后0 d 與9 d 蛋白條帶存在明顯差異。在死后0～9 d 的所有蛋白質樣本中共識別出25 個峰（按序編號為1～25），各峰含量（蛋白質相對分子質量）在死后不同時間點具有差異性，峰10 在死后0～3 d 含量較高，而在死后4～9 d 含量逐漸減少，同時某些峰（如峰14）在死后0～9 d 的含量始終維持較高的水平（圖1D）。

圖1 死后不同時間點大鼠骨骼肌蛋白質的表達Fig.1 Protein expression of rat skeletal muscles at different time points after death

PCA 模型指標良好（R2=0.866，Q2=0.654），可解釋大部分的數據變異（圖2）。死后不同時間點大鼠骨骼肌蛋白質譜峰隨死亡時間的延長呈一定的聚集趨勢，但模型為無監督學習，部分死亡時間段內差異不能完全顯現，需進一步分析。

圖2 死后不同時間點大鼠骨骼肌蛋白質譜峰的PCA 模型Fig.2 PCA model of rat skeletal muscle protein peaks at different time points after death

組間OPLS 判別分析發現，死后0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 和9 d 兩兩時間點間均可分離，模型R2、Q2值均大于0.5，且CV-ANOVA 結果顯示各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）；6 d、7 d、8 d 3 個時間點間較難分離且CV-ANOVA 中P＞0.05。

2.1.2 死亡時間預測模型

對80 份大鼠骨骼肌蛋白質樣本進行Fisher 判別分析，典型判別函數圖顯示死后10 個時間點分離效果尚可（圖3A），但部分樣本存在重疊交叉現象，模型內部交叉驗證和外部驗證的準確率分別為71.4%和66.7%，準確率較低。

圖3 大鼠骨骼肌蛋白質樣本的死亡時間預測模型Fig.3 Prediction model of postmortem interval in protein samples from rat skeletal muscles

以蛋白質樣本為數據節點、死亡時間為輸出節點、25 個峰為輸入節點的BP 神經網絡模型中，內部交叉驗證和外部驗證的準確率分別為98.2%和95.8%，以混淆矩陣結合散點圖判斷BP 神經網絡模型分類預測結果中，行代表預測時間點，列代表實際時間點，發現在5 d、7 d 各有1 例錯判（圖3B）。

經兩種模型的比較，BP 神經網絡模型具有良好的穩定性和對未知樣本的預測能力。

2.2 人體骨骼肌蛋白質表達譜峰分析

將人體骨骼肌蛋白質樣本中識別出的16 個峰按序標記為a～p，發現各峰形狀、位置基本一致（圖4A）。案例1（死后4 d）樣本的個別峰與其余8 例略有差異，其峰識別個數最少（10 個），案例6（死后22 h）樣本的峰識別個數最多（13 個）。

圖4 死后人體骨骼肌蛋白質的表達Fig.4 Protein expression of human skeletal muscles after death

進一步探究人體蛋白質譜峰含量在不同死亡時間點的分布狀態和規律，對樣本數據進行熱圖分析，發現不同譜峰含量隨死亡時間的延長發生變化，如峰a 含量隨時間的延長而增加，峰e 含量呈現先減少后增加的趨勢，峰i 與峰e 趨勢相反。根據峰含量對死亡時間進行聚類，發現死后4 d 的蛋白質樣本與死后25 h 內的蛋白質樣本明顯分離，各峰含量隨死亡時間的延長呈一定的時序性變化（圖4B）。

3 討論

死后機體蛋白質隨死亡時間延長而降解，其降解過程為基于蛋白質降解的死亡時間推斷提供了可靠的證據[9，14]。蛋白質的測定和分析多采用Western 印跡、質譜和免疫組織化學等方法[15-17]；腎、肺、肝，尤其是骨骼肌，常作為蛋白質降解的研究對象[16]?？紤]到死后機體內環境的相互作用對蛋白質的影響，多指標聯合研究可能更全面、精準。LI 等[15，18]利用質譜技術發現死后蛋白質表達與死亡時間具有相關性，為死亡時間推斷提供了新思路。然而質譜分析成本昂貴，操作流程復雜且嚴格，在一定程度上限制了其實際應用。

2100 生物分析儀基于微流控毛細管電泳技術，可對蛋白質進行高通量的自動化分析。蛋白質230試劑盒可用于分離和分析相對分子質量為14 000～230 000 的蛋白質，分辨率為10%[12]，與傳統的SDSPAGE 相比具有易于處理、可重復性及環保等優點[11]。李文晉等[12]利用蛋白質芯片檢測技術高通量、準確、便捷等特性，獲取死后大鼠肝組織蛋白質表達譜，推測其與死亡時間的關系。

本研究使用蛋白質芯片檢測技術對大鼠骨骼肌蛋白質進行檢測，結果顯示，不同死亡時間的蛋白質芯片譜峰及峰含量具有差異，其變化趨勢和程度不同。PCA 是一種數據降維方法，可利用較少的綜合指標來解釋原始變量信息[19-20]。本研究中PCA 結果顯示，死后不同時間點大鼠骨骼肌蛋白質譜峰分布有一定趨勢，但不能完全體現組間差異。OPLS 判別分析是將連續變量數據分為預測信息和不相關信息，使結果更易解釋和可視化[21]。本研究對死后不同時間點的蛋白質表達進行OPLS 判別分析發現，除死后6 d、7 d 和8 d 外，其余7 個時間點間差異均有統計學意義（P＜0.05），可能與蛋白質降解產物類型、降解速率及個體差異等因素有關。

Fisher 判別模型按分類能力提取特征，具有很強的數據壓縮能力[22-23]，本研究死亡時間預測模型效果不理想，考慮Fisher 判別對線性不可分樣本無法準確分類，因此需選擇更適合的數據分析方法。BP 神經網絡作為一種應用廣泛的多層前饋神經網絡，無需具體的數學模型，同時因其良好的穩定性、準確性和快速運算能力，在解決復雜非線性關系方面具有優勢，有很高的實際應用價值[24]。本研究中BP 神經網絡模型分析僅在死后5 d 和7 d 各有1 例錯判。對比Fisher 判別模型和BP 神經網絡模型的外部驗證準確率，BP 神經網絡模型對本研究死亡時間的預測可達到較為理想的效果，更適用于多指標聯合推斷死亡時間的研究。

本研究對大鼠樣本進行PCA 及OPLS 判別分析發現，蛋白質表達譜隨死亡時間的延長呈時序性變化，死亡時間分類預測模型具有較高準確率，與李文晉等[12]前期發現的肝組織蛋白質不同死亡時間變化規律相一致?；趧游飿颖痉治鼋Y果，本研究收集人體骨骼肌蛋白質樣本，發現不同死亡時間的芯片譜峰存在差異，譜峰含量隨死亡時間的延長發生變化。根據譜峰含量對死亡時間進行聚類分析，發現樣本在死后4 d 和25 h 兩個時間點明顯區分，各峰含量亦隨死亡時間延長呈現一定變化，說明蛋白質芯片檢測技術可應用于動物和人體樣本的死亡時間研究。此外，人體樣本死亡時間多在25 h 內，時間跨度小，且受死亡原因、現場環境條件和死后保存條件等多種因素影響，信息較為復雜。基于多方面因素的影響，本研究未能建立人體死亡時間推斷的數學模型。

綜上所述，蛋白質芯片檢測技術可快速、準確、高重復性地獲取死后不同時間點動物和人體骨骼肌組織相對分子質量為14 000～230 000 的水溶性蛋白質表達譜，結合PCA、OPLS 多維統計方法探索死后蛋白質表達與死亡時間之間的變化規律，建立多種死亡時間推斷模型，其中BP 神經網絡更適于多指標聯合死亡時間推斷，可為死亡時間推斷提供新的思路和方法。本研究在實驗動物模型的制備上盡可能模擬實際情況，如設置多個死后時間點、增加多種死亡原因、尸體冷藏等處理方法，后續將擴大尸體樣本的收集，完善相關信息，以期建立基于真實案例下的人體死亡時間蛋白質信息庫。