種豬常溫精液畸形率檢測(cè)及不確定度評(píng)定

薛 冰

（ 遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 遼陽 111000 ）

為適應(yīng)生豬產(chǎn)品消費(fèi)市場(chǎng)需求和養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展需要，遼寧省先后從丹麥、瑞典、美國、加拿大等國引進(jìn)長白、大白、杜洛克等豬種。與本地豬相比，這些引進(jìn)品種具有瘦肉率高、飼料報(bào)酬高和生長速度快等特點(diǎn)，市場(chǎng)競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)明顯，得到快速普及和推廣。但近年來由于生豬遺傳改良工作滯后，導(dǎo)致種豬質(zhì)量提高進(jìn)展緩慢，形成“引種-退化-再引種”惡性循環(huán)，良種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的推進(jìn)作用越來越不明顯。因此，以加強(qiáng)引進(jìn)種豬遺傳改良為突破口，完善種豬測(cè)定、質(zhì)量檢驗(yàn)和遺傳評(píng)估體系建設(shè)，不斷提高種豬質(zhì)量，建立自主種源體系，方可打破“引種-退化-再引種”惡性循環(huán)，對(duì)提高全省種豬質(zhì)量、規(guī)范種豬市場(chǎng)秩序、保障生豬種源安全和推動(dòng)養(yǎng)豬業(yè)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效發(fā)展具有十分重要的作用。

精液品質(zhì)影響種豬人工授精的成功率，種豬常溫精液畸形率測(cè)定是精液品質(zhì)檢測(cè)一項(xiàng)重要指標(biāo)。測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)的參數(shù)，是判定測(cè)定結(jié)果質(zhì)量的依據(jù)[1-2]。而不確定度可用于表征種豬精液品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果是否具有可靠性，因而對(duì)種豬常溫精液品質(zhì)的符合性判定起到至關(guān)重要的作用[3]。本試驗(yàn)根據(jù)GB 23238—2021 的要求[4]對(duì)種豬常溫精液品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，分析種豬常溫精液檢測(cè)畸形率全過程，對(duì)影響畸形率檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素進(jìn)行探討，評(píng)定影響其測(cè)定結(jié)果的不確定度分量，為檢測(cè)結(jié)果的可靠性和種豬精液符合性評(píng)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 精液

試驗(yàn)所用的10份種豬常溫精液來自錦州某供精站。

1.1.2 主要試劑及儀器

ML-810JZ 全自動(dòng)動(dòng)物精子分析儀（南寧松景天倫生物科技有限公司）、10 μL 移液器（EPPENDORF）以及小吸管、載玻片、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醛、甘油、吉姆薩染料等，所用試劑均為分析純，所用耗材均須無菌、無毒[5]。

檢測(cè)室內(nèi)要求干凈、整潔，配備控溫和控濕設(shè)備，保證工作時(shí)室溫在20～25 ℃，相對(duì)濕度在35%～55%，并做好溫濕度記錄[6]。

1.1.3 試劑配制

配制磷酸鹽緩沖液：0.55 g 磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和2.25 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）溶于蒸餾水并定容至100 mL容量瓶。

配制中性福爾馬林固定液：0.55 g 磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和2.25 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）溶于約50.0 mL 0.89%氯化鈉，溶解后加入8.0 mL 40%甲醛（使用前經(jīng)碳酸鎂中和過濾），再加入0.89%氯化鈉溶液定容至100.0 mL。

吉姆薩染液：吉姆薩原液2.0 mL 與磷酸鹽緩沖液3.0 mL、蒸餾水5.0 mL混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗(yàn)方法

種豬常溫精液按照GB 23238—2021 要求進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)由檢驗(yàn)人員獨(dú)立檢測(cè)10份種豬常溫清液，用數(shù)字標(biāo)記好精子畸形率指標(biāo)。

1.2.1 制片、染色

抹片：吸取一滴精液滴于載玻片一端，取另一載玻片（要求邊緣光滑）與放置樣品的載玻片呈35°并輕輕滑動(dòng)，均勻地將樣品涂于載玻片上，自然風(fēng)干擺放約5 min，每個(gè)樣品須制作兩個(gè)相同抹片。

福爾馬林固定：將1.0～2.0 mL中性福爾馬林固定液滴于已風(fēng)干的抹片上，固定時(shí)間15 min，用蒸餾水沖去固定液，自然風(fēng)干。

吉姆薩染色：取固定好的抹片，反扣于有平槽的有機(jī)玻璃上，將吉姆薩染色液用滴管滴于槽中，使染色液完全覆蓋抹片和平槽，染液充分接觸抹片，染色1.5 h，之后用洗瓶沖去染液，放置晾干待檢[7]。

1.2.2 精子畸形率

取制備好的抹片置于顯微鏡下觀察，調(diào)整視野為400～600 倍，每個(gè)抹片觀察左、右兩個(gè)區(qū)各200 個(gè)以上的精子，觀察順序?yàn)閺淖蟮接摇纳系较拢呌^察邊計(jì)數(shù)，計(jì)算兩個(gè)抹片畸形率的平均值。兩個(gè)抹片畸形率差值不大于6[8]可認(rèn)為符合要求，不符應(yīng)重新按上述流程制作[4]。精子畸形率按公式（1）計(jì)算：

式中：A為畸形率；A1為畸形精子數(shù)；S為精子總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

建立不確定度數(shù)學(xué)模型，得到畸形率測(cè)量結(jié)果不確定度主要來源評(píng)定的重復(fù)性，故屬于A類不確定度。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度、相對(duì)擴(kuò)展不確定度，得出其擴(kuò)展不確定度。

2.2 不確定度數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)GB 23238—2021 的規(guī)定，按標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法以及公式建立的測(cè)量不確定度數(shù)學(xué)模型見公式（1），為種豬常溫精液檢測(cè)畸形率的測(cè)量不確定度。由公式（1）可知，A1、S為種豬精液品質(zhì)精子畸形率不確定度的分量來源。

2.3 儀器不確定度計(jì)算U(t)

可查詢?nèi)詣?dòng)動(dòng)物精子分析儀投影顯微鏡的分辨率（△）為0.1 μm，假定生物投影顯微鏡的分辨率最大允差為均勻分布，其產(chǎn)生的不確定度為：U(t)=△/k=0.005 8。

2.4 檢測(cè)不確定度計(jì)算

圖1 種豬常溫精液精子畸形率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.1 Mean and standard deviation of sperm malformation rate in normal temperature semen of breeding pigs

表1 種豬常溫精液精子畸形率Tab.1 Sperm abnormality rate of boar normal temperature semen

試驗(yàn)結(jié)果也可采用擴(kuò)展不確定度表示，取包含因子K=2，則擴(kuò)展不確定度為U=K×U（M）＝1.68%（置信概率約95%）。

3 討論

研究表明，精子畸形率是除精子活力之外，對(duì)受精率影響最大的指標(biāo)[9]。本文建立測(cè)量不確定度模型，通過檢測(cè)種豬常溫精液精子畸形率，針對(duì)主要影響種豬精子畸形率檢測(cè)結(jié)果可靠性的因素進(jìn)行分析，建立種豬精液品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果可靠性評(píng)估的方法。檢測(cè)方法依據(jù)《種豬常溫精液》（GB 23238—2021），不確定度計(jì)算依據(jù)《用蒙特卡洛法評(píng)定測(cè)量不確定度》（JJF 1059.2—2012）。

本試驗(yàn)中精子畸形率的檢測(cè)設(shè)備為生物投影顯微鏡。付雪林等[3]認(rèn)為，生物投影顯微鏡分辨率產(chǎn)生的不確定度分量對(duì)精子畸形率檢測(cè)產(chǎn)生的準(zhǔn)確度影響最小，與本文儀器不確定度的計(jì)算結(jié)果（0.005 8）相符。本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，生物投影顯微鏡分辨率產(chǎn)生的不確定度分量對(duì)精子畸形率檢測(cè)產(chǎn)生的準(zhǔn)確度影響較小。李何君等[10]結(jié)果表明，精子畸形率檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.9%，擴(kuò)展不確定度為1.8%，與本研究結(jié)論相近。

精子畸形率是精子經(jīng)染色液染色后在顯微鏡下判別畸形精子的比率。常見的精子染色方法有吉姆薩染色法[11]、考馬斯亮藍(lán)染色法[12]、伊紅染色法[13]等，本試驗(yàn)參考國家標(biāo)準(zhǔn)《種豬常溫精液》（GB 23238—2021），采用吉姆薩染色法對(duì)精子進(jìn)行染色，精子染色后檢測(cè)確定配制吉姆薩染色液的濃度不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。精子畸形率檢測(cè)時(shí)需要檢驗(yàn)人員用肉眼在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，不同的操作人員對(duì)畸形精子的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)也會(huì)存在差別[3]。此外，制樣和固定、鏡檢過程中的操作對(duì)精子畸形率測(cè)定結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生影響，因此，操作人員的技術(shù)水平對(duì)精子畸形率的不確定度分量的影響較大。

種豬常溫精液是開展人工授精技術(shù)的基礎(chǔ)，是提高豬人工授精率的關(guān)鍵因素。抓好種豬常溫精液生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，建立健全精液的質(zhì)量監(jiān)管體系，如精液的生產(chǎn)、檢測(cè)、保存和運(yùn)輸?shù)冗^程，能夠保證優(yōu)秀種公豬的精液品質(zhì)，充分發(fā)揮優(yōu)秀種公豬的種用價(jià)值，提高母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[14]。豬常溫精液供精中心可實(shí)現(xiàn)優(yōu)秀種豬精液規(guī)模化儲(chǔ)存和大范圍的資源共享，養(yǎng)殖戶使用豬常溫精液可降低飼養(yǎng)成本，阻斷引種造成的傳染性疾病傳播，減輕防疫工作壓力，加快豬群品種改良速度，提升良種覆蓋率，大幅提高養(yǎng)殖收益[15-16]。對(duì)豬常溫精液精子畸形率等各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析可為優(yōu)秀種質(zhì)資源的篩選和使用提供依據(jù)，把好質(zhì)量關(guān)，對(duì)增加養(yǎng)殖效益、推動(dòng)養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重大的作用。此外，為驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度也可定期將樣本送至其他具有檢測(cè)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)、分析[7]，查找差距以提高自身檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究中精子畸形率的檢測(cè)設(shè)備為生物投影顯微鏡，經(jīng)檢測(cè)后產(chǎn)生的不確定度分量對(duì)精子畸形率檢測(cè)的準(zhǔn)確度影響較小。精子著色的深淺由配制吉姆薩染色液濃度的準(zhǔn)確性影響，配制染色液的濃度準(zhǔn)確性不會(huì)對(duì)精子畸形率產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)精子畸形率是在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，檢驗(yàn)人員在制樣和固定、鏡檢過程中的操作對(duì)精子畸形率測(cè)定結(jié)果具有決定性作用，對(duì)精子畸形率的不確定度分量的影響較大。

綜上所述，在今后的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)控活動(dòng)中，應(yīng)加強(qiáng)人員技術(shù)評(píng)比以及對(duì)相關(guān)理論知識(shí)的學(xué)習(xí)，提高技術(shù)人員試驗(yàn)操作過程的熟練程度，多進(jìn)行崗位練兵，以達(dá)到提高檢測(cè)精子畸形率準(zhǔn)確度的目的，也可增加檢測(cè)次數(shù)提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)室在選擇生物投影顯微鏡時(shí)要多進(jìn)行比較，以減少試驗(yàn)設(shè)備對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。