山豆根多糖對豬圓環(huán)病毒Ⅱ型感染3D4/2細胞增殖活性及炎癥信號通路基因調(diào)控作用的研究

韋秋旭，趙 怡，楊 劍，陳虹伶，李禧夢，馮國越，胡焜翔，胡庭俊

（ 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005 ）

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（porcine circovirus type 2，PCV2）是豬圓環(huán)病毒相關疾病（PCVAD）的主要病原體，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[1]。PCV2 亦與其他病毒產(chǎn)生共感染，如與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的混合感染在國內(nèi)外均造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。且由于病毒基因組不斷進化，疫苗在豬生產(chǎn)中難以起到很好的保護作用[3]，因此尋找控制疾病發(fā)展的新方法迫在眉睫。

有研究表明，天然化合物具有良好的抗病毒作用[4-5]，中草藥中的抗病毒天然化合物的篩選備受關注。山豆根（Sophorae tonkinesisRadix.）是豆科植物越南槐（Sophora tonkinensisGapnep.）的干燥根與根莖，又稱廣豆根、苦豆根，具有清熱解毒、消腫止痛的功效[6]。山豆根多糖（SSP）是從山豆根中提取出的有效多糖成分，具有抗氧化、抗病毒、增強機體免疫等[7-8]活性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SSP能夠降低PCV2感染誘發(fā)的RAW264.7細胞的炎癥反應[7]。本試驗旨在研究SSP對豬肺泡巨噬細胞系3D4/2細胞體外增殖活性的影響及SSP對PCV2感染誘發(fā)的炎癥相關信號通路基因的調(diào)控，旨在為SSP的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PCV2（SH 株）由南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室惠贈，由廣西大學動物科學技術學院基礎獸醫(yī)藥理實驗室經(jīng)PK-15 細胞增殖保存，通過Reed-Muench法測定病毒滴度為104TCID50/0.1 mL。

試驗所用SSP由廣西大學實驗室提取并保存，內(nèi)毒素含量＜0.005 μg/g。

3D4/2 細胞為豬肺泡巨噬細胞系傳代細胞，由廣西大學動物科學技術學院基礎獸醫(yī)藥理實驗室凍存?zhèn)鞔?/p>

1.2 主要試劑與儀器

CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術）；RNAiso plus（北京寶日醫(yī)生物技術有限公司）；5× All-in-One Master Mix 及BlastaqTMGreen 2× qPCR Master Mix（愛必夢生物科技有限公司）。

Multimode Plate Reader 多功能酶標儀（瑞士PerkinElmer）；超微量紫外分光光度計（美國GE 公司）；梯度PCR 儀、CFX96TMReal-Time System（美國BIO-RAD 公司）；3K-15 臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）。

1.3 CCK-8 法測定SSP 對PCV2 感染3D4/2 細胞活性的影響

將3D4/2 細胞以1×105cell/mL，以每孔100 μL 鋪于96孔板中，共設7組，每組12個重復，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。經(jīng)DMEM 完全培養(yǎng)液或PCV2 處理2 h 后，分別加入含藥物或不含藥物培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0、12、24、48 h，終止培養(yǎng)后按照CCK8 試劑盒說明書測定細胞增殖活性。具體試驗分組及處理見表1。

表1 SSP對PCV2感染3D4/2細胞活性的影響試驗分組與處理Tab.1 Grouping and treatment of the effect of SSP on the activity of 3D4/2 cells infected with PCV2

1.4 qRT-PCR 檢測SSP 對PCV2 感染3D4/2 細胞通路相關基因的影響

將3D4/2 細胞以2×105cell/mL，以每孔1 mL 鋪于12 孔板中，共設5 組，每組3 個重復，試驗分組及處理見表2。

表2 SSP對PCV2感染3D4/2細胞通路相關基因的影響試驗分組與處理Tab.2 Grouping and treatment of genes related to the pathway of 3D4/2 cells infected with PCV2 by SSP

作用24 h 后，棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次后加入RNAiso Plus 裂解5 min，按照說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后按照表3引物進行熒光定量PCR擴增。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequence

反應體系（20 μL）：酶10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL。

擴增條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。熔解曲線按照儀器自身設置進行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析，LSD法進行多重比較。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 SSP 對PCV2 感染3D4/2 細胞增殖活性的影響（見圖1）

圖1 SSP對PCV2感染的3D4/2細胞增殖活性的影響Fig.1 Effect of SSP on proliferation activity in PCV2 infected-3D4/2 cells

為評估SSP 對PCV2 感染的豬肺泡巨噬細胞系3D4/2細胞體外增殖活性調(diào)節(jié)作用，使用CCK-8 法測定了不同濃度SSP對PCV2感染的3D4/2細胞活性的影響。

由圖1（a）可知，各組細胞未經(jīng)病毒感染和藥物作用時，細胞活性水平均在0.95 以上，且各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

由圖1（b）可知，PCV2感染3D4/2細胞12 h后，與細胞對照組相比，PCV2模型組細胞活性極顯著降低（P＜0.01）；與PCV2 模型組相比，SSP200 組及SSP400 組細胞活性均顯著升高（P＜0.05）。

由圖1（c）可知，PCV2感染3D4/2細胞24 h后，與細胞對照組相比，PCV2模型組細胞活性極顯著降低（P＜0.01）；與PCV2 模型組相比，SSP100 組及SSP200 組細胞活性顯著 升 高（P＜0.05），SSP400 組 細 胞 活 性 極 顯 著 升 高（P＜0.01）。

由圖1（d）可知，PCV2感染3D4/2細胞48 h后，與細胞對照組相比，PCV2模型組細胞活性極顯著降低（P＜0.01）；與PCV2 模型組相比，SSP100 組及SSP200 組細胞活性顯著 升 高（P＜0.05），SSP400 組 細 胞 活 性 極 顯 著 升 高（P＜0.01）。

綜上所述，SSP 濃度小于50 mg/L 時在各時間點對3D4/2 細胞活性無顯著影響，與PCV2 模型組相比差異均不顯著（P＞0.05）；經(jīng)100～400 mg/L SSP 處理后，細胞活性在12 h 開始升高，且隨著時間增加細胞活性逐漸升高，但均低于正常活性，表明100～400 mg/L SSP 能夠顯著提高PCV2感染的3D4/2細胞體外增殖活性。

2.2 SSP對PCV2感染3D4/2細胞炎癥相關信號通路的影響（見圖2、圖3）

圖2 β-actin、p38和p65基因熔解曲線Fig.2 Melt curves of β-actin, p38 and p65 gene

圖3 SSP對PCV2感染的3D4/2細胞炎癥信號通路基因表達的影響Fig.3 Effect of SSP on inflammatory pathway gene expressions in PCV2-infected 3D4/2 cells

病毒感染能夠誘發(fā)細胞內(nèi)信號通路激活，本試驗使用qRT-PCR 檢測通路基因表達的變化以得到通路激活情況，結果見圖2。由圖2可知，熒光定量PCR熔解曲線峰單一無雜峰，引物設計合理，無非特異性產(chǎn)物。

由圖3 可知，與細胞對照組相比，PCV2 感染24 h 后3D4/2 細胞MAPK p38 mRNA 表達水平顯著上升（P＜0.05）；與PCV2模型組相比，不同濃度SSP作用后，p38表達水平極顯著下降（P＜0.01）。與細胞對照組相比，PCV2感染24 h后的3D4/2細胞內(nèi)NF-κB p65 mRNA表達水平極顯著上升（P＜0.01）；與PCV2 模型組相比，各濃度SSP 作用后能夠極顯著降低3D4/2 細胞內(nèi)NF-κB p65 mRNA表達水平（P＜0.01）。

3 討論

細胞增殖是細胞生長的重要生理功能之一，是了解基因、蛋白質(zhì)和通路作用機制的重要手段[9]。中草藥多糖具有提高細胞活性、提升抗氧化能力、抗病毒能力等多種生物活性[10]。Deng 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠通過促進miR-136-5p 和miR-149-5p 等miRNA 的表達，進而改善高糖和棕櫚酸誘導的小鼠胰腺β 細胞凋亡，促進細胞增殖。靈芝多糖-金納米復合材料能夠促進脾細胞中CD4+和CD8+T 細胞的增殖，進而抑制癌癥的進程[12]。委陵菜多糖能夠增加RAW264.7 細胞NO 的分泌，并增進脾淋巴細胞增殖，激活NF-κB 信號通路[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SSP在25～400 mg/L濃度范圍內(nèi)對細胞無毒性作用[14]。本研究探討了SSP 對PCV2感染3D4/2細胞后細胞活性的調(diào)節(jié)作用，結果顯示，100～400 mg/L SSP能夠顯著調(diào)節(jié)PCV2感染誘發(fā)的細胞活性降低現(xiàn)象，并且呈劑量依賴性。

有研究表明，病毒感染與炎癥密切相關。細胞因子通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 途徑誘導核因子-kB（NF-κB）活性，NF-κB通過釋放各種可誘導的炎性細胞因子在炎癥反應中起到關鍵作用[15-16]。NF-κB 信號通路和MAPK 信號通路是重要的炎癥信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 通過激活NF-κB 與MAPKs 途徑導致促炎介質(zhì)和細胞因子的過量產(chǎn)生[17]。而病毒刺激能夠誘發(fā)細胞炎癥反應，激活NF-κB信號通路途徑，藥物可通過抑制NFκB活化從而抑制病毒等引發(fā)的炎癥反應。山柰酚能夠通過p38 MAPK 信號通路降低炎性因子的表達發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護作用[18]。江勇等[19]研究發(fā)現(xiàn)，白術多糖能夠抑制白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-1β（IL-1β）等細胞因子的合成，通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路的活化，進而保護大鼠腸黏膜的免疫功能。

本研究結果顯示，PCV2 感染后3D4/2 細胞中p65 和p38 基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增多，而SSP 作用24 h 能夠顯著降低其表達，表明SSP 可抑制PCV2 感染誘導的3D4/2 細胞炎癥信號通路激活，其抗炎作用與抑制NF-κB 和MAPK通路的激活相關，這可能是山豆根多糖抗炎活性與抗病毒的重要機制，可為SSP的臨床應用提供參考。

4 結論

本研究結果表明，100～400 mg/L SSP 作用12～48 h 能夠顯著提升PCV2 感染誘發(fā)的3D4/2 細胞活性，并在作用24 h時顯著降低PCV2感染誘發(fā)的3D4/2細胞中p65和p38基因的表達，但SSP 是否是通過NF-κB 和MAPK 信號通路調(diào)節(jié)PCV2誘發(fā)的炎癥反應仍需進一步試驗加以研究。