HPV感染與ERK信號通路關鍵因子在宮頸癌中的交互效應及臨床意義

張曉敏, 楊年紅

(湖北民族大學附屬民大醫院婦科, 湖北 恩施 445000)

全球每年約有50萬宮頸癌新發病例,中國每年新增13.15萬宮頸癌病例,約占全球總數1/3[1,2]。高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)持續感染是誘發宮頸癌及癌前病變重要因素,宮頸癌發病高峰集中于40歲,HPV感染發病高峰集中于20歲,從感染HPV發展為宮頸癌這種倒金字塔式流行病學分布說明還有更多其他因素參與宮頸癌發生發展[3,4]。分子和細胞生物學方法揭示,ERK信號通路異常活化可抑制細胞分化、凋亡功能,增強細胞異常增殖和侵襲能力,參與多種實體瘤(肝癌、乳腺癌、前列腺癌)發病過程[5]。ERK信號通路涉及核不均一核糖核蛋白E1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HnRNP E1)、磷酸化細胞外信號調節激酶1/2(P-extracellular regulated kinase1/2,p-ERK1/2)、磷酸化非受體酪氨酸激酶(p-Src)等關鍵因子,目前有關ERK信號通路關鍵因子在宮頸癌中表達及其與HPV感染間關系研究甚少,本研究初步探究兩者在宮頸癌中交互效應,為探索宮頸癌鑒別診斷及靶向治療方案提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2020年10月至2022年10月我院收治的90例宮頸癌患者作為研究組,年齡20～60(45.05±3.33)歲;體質量指數18～23(20.55±0.71)kg/m2;FIGO分期:49例ⅠB期,41例ⅡA期;腫瘤直徑1.0～4.0(2.56±0.41)cm;淋巴結轉移:21例有,69例無;分化程度:60例中高分化,30例低分化;病理分型:18例腺癌,72例鱗癌。另納入90例宮頸上皮內瘤變患者作為對照組,年齡22～60(43.99±4.58)歲;體質量指數19～23(20.64±0.58)kg/m2;病理類型:40例CIN Ⅰ～Ⅱ級,50例CIN Ⅲ級。兩組年齡、體質量指數均衡可比(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會審核批準。納入標準:研究組符合《婦產科學》診斷標準[6]:FIGO分期ⅠB期、ⅡA期,均未進行放療、化療等相關生物學治療,病理活檢證實宮頸癌;對照組符合《宮頸癌及癌前病變病理診斷規范》診斷標準[7];均為女性;患者及家屬知曉并簽署同意書。排除標準:伴卵巢癌、子宮內膜癌、子宮腺肌癥等生殖系統疾病;重要臟器器質性病變;哺乳期或妊娠期女性;凝血異常;伴有明確急慢性感染性疾病;其他惡性腫瘤(胃癌、肺癌、肝癌)。

1.2方 法

1.2.1HPV檢測:取膀胱截石位,充分顯露宮頸口,無菌棉球擦拭宮頸外口分泌物,將HPV取樣器(江蘇康健醫療用品有限公司)插入宮頸內口,順時針旋轉3周,停留10s左右,置于無菌取樣管,離心后得到沉淀細胞液,加入細胞裂解液,提取DNA,應用艾吉康生物科技北京有限公司生產HPV試劑盒測定,涉及10種高危HPV基因型(16、18、31、33、35、39、45、58、52、51)。當樣品HPV相對光單位表達值/陽性標準品閾值<1.0判定為陰性,≥1.0判定為陽性,并將陽性分為3個病毒負荷量級別(1～100、101～1000、>1000)。

1.2.2ERK信號通路關鍵因子檢測

1.2.2.1免疫組化染色:①磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)將所需抗體按比例稀釋,HnRNP E1為1∶100,p-ERK1/2、p-Src為1∶150;②經病理活檢獲取子宮頸組織,石蠟包埋,連續切片(每片約4 μm),脫蠟水化,PBS沖洗3次;③將切片置于枸櫞酸鹽修復液,高壓鍋內熱修復,100 ℃ 3min,自然冷卻至室溫,PBS沖洗3次,3%過氧化氫(H2O2)封閉,室溫孵育10min,PBS沖洗3次;④甩去PBS液體,每張切片滴加50μL一抗,4℃過夜孵育;⑤PBS沖洗3次,滴加試劑1,37℃孵育20min,PBS沖洗3次,滴加試劑2,37℃孵育30min,PBS沖洗3次;⑥滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色液,室溫放置5min,自來水沖洗,行蘇木精復染、鹽酸酒精分化、氨水返藍、脫水、中性樹脂封片等操作,顯微鏡下觀察結果,拍照保存。每次實驗均設置陽性對照、陰性對照及空白對照。

1.2.2.2結果判定:①定位:HnRNP E1、p-ERK1/2表達定位于細胞核,p-Src表達定位于細胞漿,出現棕黃色顆粒即為陽性;②評分標準:由兩名觀察者盲式閱片,陽性范圍含>50%(3分)、26%～50%(2分)、1～25%(1分)、0%(0分),染色程度含深棕色(3分)、棕色(2分)、淡棕色(1分)、不著色(0分),兩者相加即為總分,總分超過2分即為陽性。

1.3統計學分析:應用SPSS22.0軟件包處理數據,計數資料以n(%)表示,行χ2檢驗,Spearman分析相關性,Logistic回歸方程分析交互作用。P<0.05表明差異有統計學意義。

2 結 果

研究組HPV感染率明顯高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級(P<0.05),詳見表1;研究組HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白陽性率均高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級(P<0.05),詳見表2;研究組不同FIGO分期、HPV感染、分化程度患者HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05),見表3;Spearman顯示,宮頸癌患者FIGO分期、HPV感染、分化程度與HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白呈正相關(P<0.05),詳見表4;HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白之間均呈正相關,故可能存在多重共線性作用。以宮頸癌患者是否有HPV感染(是=1,否=0)為因變量,HnRNP E1蛋白、p-ERK1/2蛋白、p-Src蛋白及三者交互作用交量為自變量,一般臨床病理特征為協變量,行二分類Logistic回歸分析,結果顯示,HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白及三者交互作用是宮頸癌患者HPV感染高危因素(P<0.05),詳見表5。

表1 比較研究組和對照組HPV感染情況n(%)

表2 比較研究組和對照組患者ERK信號通路關鍵因子表達n(%)

表3 比較研究組不同臨床病理特征患者ERK信號通路關鍵因子表達n(%)

表4 宮頸癌臨床病理特征與ERK信號通路關鍵因子表達相關性(r/P)

表5 ERK信號通路關鍵因子對宮頸癌HPV感染的影響

3 討 論

2020年我國新發宮頸癌病例11萬,因宮頸癌死亡病例約6萬,宮頸癌發病與HPV感染密切相關,中國最常見5種高危HPV型別分別是16、18、58、52、33,其中HPV16感染率達46.5%～53.2%[8]。本研究發現研究組HPV感染率高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級(P<0.05),與劉曉旭等[9]研究觀點相近。約1/3感染HPV 16亞型婦女在1年內演變為CIN,約15%CIN患者演變為宮頸癌[10]。由此可見,僅少數感染HPV女性可發展為宮頸癌,說明仍存在其他協同致癌因素存在,明確HPV以外的其他致癌因素是宮頸癌重點研究方向。

ERK信號通路異常活化與宮頸癌細胞增殖密切相關,但多集中于綜述方面,鮮見臨床實驗研究。國外學者提出,隨著正常宮頸組織向宮頸癌發展,p-ERK1/2表達逐漸增強,與本研究觀點相符[11]。ERK1/2是ERK家族重要成員,正常情況下位于胞質內,激活后移位于細胞核,經磷酸化反應調節細胞代謝和功能,影響細胞產生特定的生物學效應。推測原因其參與突變Ras基因所致宮頸癌Hela細胞增殖有關,發揮抗凋亡效應,促進癌細胞生長、分裂及向惡性轉化。本研究發現,研究組HnRNP E1蛋白陽性表達率高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級,說明HnRNP E1蛋白是子宮頸病變過程中早期事件。HnRNP E1含有3個高度保守KH結構域,除具有HnRNPs共有調控基因轉錄、翻譯功能外,還可參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學過程。陳霄[12]學者發現,HnRNP E1蛋白陽性率隨子宮頸癌變進展而升高。但有學者持反對意見,認為HnRNP E1蛋白陽性率隨子宮頸病變進展而降低,推測與樣本量、種族差異等有關[13],有關HnRNP E1蛋白在宮頸癌發生發展中具體機制有待深入研究。Src屬非受體蛋白酪氨酸激酶,可被細胞膜表面G蛋白耦連受體、生長因子受體激活,激活多條信號通路,產生多種生物學效應,在腫瘤研究中備受關注。已知研究表明,Src在宮頸癌組織及細胞系中活性增強,推測與其促進宮頸癌細胞周期向G2/M期轉變,加快腫瘤細胞增殖、轉移有關[14]。本研究數據顯示,研究組p-Src蛋白陽性率為53.33%,明顯高于對照組CIN Ⅰ～Ⅱ、 Ⅲ級(P<0.05),說明p-Src蛋白在宮頸癌及宮頸上皮內瘤變鑒別診斷中具有提示作用。動物實驗證實,抑制Src活性可有效抑制大鼠宮頸癌細胞增殖、生長,有望成為宮頸癌治療靶點之一[15]。

相關性顯示,宮頸癌HPV感染與HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白呈正相關,且3種蛋白間均呈正相關,說明可能存在多重共線性作用。經Logistic回歸方程檢驗發現,HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白及三者交互作用是宮頸癌患者HPV感染高危因素(P<0.05)。HPV E6/E7蛋白可通過調節表皮生長因子受體來調控Src蛋白表達,刺激ERK信號通路,誘導ERK1/2、HnRNP E1表達,促進宮頸癌細胞生長和增殖。同時HnRNP E1作為特殊RNA結合蛋白,所含KH域可與許多病毒基因結合,如HPV E2/E3、E6/E7,協同作用下促進宮頸癌病情進展。因此,防控HPV感染或研發以ERK信號通路關鍵因子為干預靶點的藥物有望降低兩者形成交互效應機會,降低宮頸癌發生風險,保障中國廣大女性身心健康。

綜上所述,HPV感染及ERK信號通路關鍵因子陽性表達均可增加宮頸癌發病風險,兩者存在正向交互作用,可為宮頸癌鑒別診治提供有利參考信息。