miR-105-5p調控CDC5L表達對膠質瘤細胞增殖遷移的影響

宋海龍, 徐東為, 余秋男, 荊彥平, 李世沖, 劉建中, 劉京讓

(河南省黃河三門峽醫院神經外科, 河南 三門峽 472000)

腦膠質瘤是最一種常見的原中樞神經系統腫瘤之一,嚴重危害患者生命健康[1]。世界衛生組織根據腦膠質瘤的病理特性將膠質瘤分為I～IV級,I級膠質瘤界限明顯,生長緩慢,很少擴散;IV級膠質母細胞瘤惡性程度高,預后差,中位生存期不足2年[2]。膠質瘤具有細胞增殖快、血管生成快,轉移、侵襲能力強等特點,急需探索膠質瘤準確分子機制和可靠治療靶點以改善相關疾病。微小RNA(microRNA,miRNA)可通過調控基因轉錄影響腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲,是腫瘤靶向治療研究的熱點之一[3]。微小RNA-105-5p(microRNA-105-5p,miR-105-5p)在前列腺癌、肝癌、膠質瘤等腫瘤細胞中表達水平下降,并與患者預后有關,可在多種癌癥中發揮抑癌作用[4]。細胞分裂周期蛋白5樣蛋白抗體(Cell division cycle 5-like protein,CDC5L)可參與細胞周期調控,通過與細胞周期檢查點蛋白結合,調控細胞有絲分裂。研究表明,CDC5L高表達的神經母細胞瘤患兒存活率顯著降低,CDC5L水平被證實與神經母細胞瘤不良病理類型及不良預后有關[5]。此外,Targetscan數據庫分析顯示,miR-105-5p與CDC5L存在結合位點,推測兩者存在靶向調控關系,共同作用于細胞生長。因此本文選擇miR-105-5p、CDC5L進行研究,并分析二者與膠質瘤細胞增殖、遷移的關系,以期為揭示膠質瘤的分子機制及靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器:人腦膠質瘤細胞U251由中國科學院上海細胞庫提供;miR-105-5p mimics及miR-105-5p陰性對照[miR-105-5p模擬物(miR-105-5p mimics)NC]、CDC5L siRNA及陰性對照(CDC5L siRNA NC)、pcDNA-CDC5L及陰性對照(pcDNA)質粒均由北京擎科生物有限公司合成;CDC5L、細胞周期蛋白(CyclinDl)、基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、MMP-9及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(p21)、GAPDH兔單克隆抗體(貨號:ab129114、ab16663、ab92536、ab76003、ab109520、ab181602)均購自英國Abcam公司;Lipo2000轉染試劑(貨號:11668030)、熒光素酶活性檢測試劑盒(貨號:16161)、Trizol試劑(貨號:10296028)、逆轉錄試劑盒(貨號:K16225)均購自Thermo Fisher Scientific公司;CCK-8試劑盒(貨號:GK10001)購自美國GLPBIO公司。LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司;Epoch酶標儀購自美國Biotek公司;CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2方 法

1.2.1臨床樣本收集:選取本院經神經外科手術切除的人腦膠質瘤組織樣本35例,膠質瘤患者術前均未行放、化療,手術均為開顱切除,并經病理檢查證實為人腦膠質瘤,其中男性19例,女性16例,年齡30～68歲;另選因腦外傷行減壓術的正常腦組織樣本35例作為對照,其中男性18例,女性17例,年齡29～71歲,所有樣本均保存在-80℃冰箱中。所有研究對象均知情同意。

1.2.2細胞培養及分組:在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養U251細胞,待細胞融合度達80%～90%,胰蛋白酶消化收集細胞進行后續實驗。并將各質粒轉染U251細胞,分為control組(不處理)、miR-NC組(轉染miR-105-5p mimics NC)、miR-105-5p mimics組(轉染miR-105-5p mimics)、si-NC組(轉染CDC5L siRNA NC)、si-CDC5L組(轉染CDC5L siRNA)、pcDNA組(共轉染miR-105-5p mimics及CDC5L空載體pcDNA)、miR-105-5p mimics+pcDNA-CDC5L組(共轉染miR-105-5p mimics及pcDNA-CDC5L)。轉染48h后,進行后續實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-105-5p、CDC5L表達:采用Trizol試劑提取細胞及組織樣本中的總RNA,并逆轉錄為cDNA,具體操作按照逆轉錄試劑盒說明進行。qRT-PCR反應體系(20 μL):2 μL cDNA、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μL、7 μL ddH2O。在LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀上擴展,2-△△Ct法計算miR-105-5p、CDC5L的相對表達量,引物序列見表1。

表1 miR-105-5p CDC5L及相應內參U6 GAPDH的引物序列

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖:將1.2.1中各組細胞鋪于96孔板中(密度為5×103個/孔),每組設6個復孔。分別于培養24h、48h、72h時,向96孔板中加入10mL CCK-8溶液,孵育2h,酶標儀檢測各孔OD值。OD值越大,細胞增殖能力越強。

1.2.5Transwell檢測細胞遷移:制備1.2.1中各組的細胞重懸液(密度為1×106個/mL),取200μL加入Transwell小室上室中,下室加10%胎牛血清的DMEM培養基,37℃、5%CO2培養24h,取出小室,擦除微孔膜上層細胞,多聚甲醛固定10min,結晶紫染色5min,鏡下隨機選5個視野計數,以平均值表示遷移細胞數。

1.2.6Western blot法檢測CDC5L、CyclinDl、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達:提取轉染48h后的各組細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。適量蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉至PVDF膜,封閉液封閉1h,加入各蛋白對應一抗,4℃過夜,加入二抗,室溫孵育2h,ECL顯色、曝光,Quantity One凝膠軟件分析各條帶灰度值。各蛋白水平以目的條帶與GAPDH條帶比值表示。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗驗證miR-105-5p與CDC5L的靶向關系:Targetscan網站、miRDB網站預測miR-105-5p與CDC5L 3'UTR的結合位點。根據miR-105-5p結合CDC5L 3’UTR區域序列,構建野生型CDC5L-3’UTR-WT及突變型CDC5L-3’UTR-MUT質粒,分別與miR-105-5p mimics或miR-105-5p mimics NC共轉染U251細胞48h,收集細胞并制備細胞提取物,測量各組熒光素酶活性。

2 結 果

2.1膠質瘤組織中miR-105-5p、CDC5L mRNA的表達:膠質瘤組織miR-105-5p表達量低于正常腦組織(P<0.05),CDC5L mRNA表達量高于正常腦組織(P<0.05)。見表2。

表2 膠質瘤組織中miR-105-5p CDC5L mRNA的表達

2.2miR-105-5p靶向調控CDC5L表達:Targetscan分析顯示,miR-105-5p與CDC5L 3’UTR區存在特異互補序列,見圖1。miR-105-5p表達水平與CDC5L表達水平呈負相關(r= -0.512,P=0.002),見圖2。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,與CDC5L-WT+miR-105-5p NC組相比,CDC5L-WT+miR-105-5p mimics組熒光素酶活性降低(P<0.05),見表3。

圖1 各組U251細胞遷移情況

圖2 miR-105-5p與CDC5L 相關性

表3 各組U215細胞雙熒光素酶報告基因檢測結果

2.3過表達CDC5L逆轉miR-105-5p對U251細胞增殖、遷移的作用:與control組、si-NC組比較,si-CDC5L組24h、48h、72h OD值、遷移細胞數、CDC5L mRNA表達量均降低(P<0.05);與control組、miR-NC組比較,miR-105-5p mimics組miR-105-5p表達量升高[(1.95±0.46)vs(0.99±0.03),P<0.05],24h、48h、72h OD值、遷移細胞數、CDC5L mRNA表達量均降低(P<0.05);與miR-105-5p mimics組、pcDNA組比較,miR-105-5p mimics+pcDNA-CDC5L組U251細胞24h、48h、72h OD值、遷移細胞數增加(P<0.05),CDC5L mRNA表達量升高(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 過表達CDC5L逆轉miR-105-5p對U251細胞增殖、遷移的作用

2.4過表達CDC5L逆轉miR-105-5p對U251細胞增殖、遷移相關蛋白表達的影響:與control組、si-NC組比較,si-CDC5L組p21蛋白表達量升高(P<0.05),CDC5L、CyclinDl、MMP-2、MMP-9蛋白表達量均降低(P<0.05);與control組、miR-NC組比較,miR-105-5p mimics組p21蛋白表達量升高(P<0.05),CDC5L、CyclinDl、MMP-2、MMP-9蛋白表達量均降低(P<0.05);與miR-105-5p mimics組、pcDNA組比較,miR-105-5p mimics+pcDNA-CDC5L組CDC5L、CyclinDl、MMP-2、MMP-9蛋白表達量升高,p21蛋白表達量下降(P<0.05)。見圖4,表5。

表5 過表達CDC5L逆轉miR-105-5p對U251細胞增殖遷移相關蛋白表達的影響

3 討 論

神經膠質瘤作為中樞神經系統疾病,具有極高的致死率[6]。惡性膠質瘤具有彌漫性、浸潤性,腫瘤邊界不清,手術治療難以完全清除,患者預后差等特點[7]。隨著分子生物學的發展,分子靶向治療逐漸成為治療膠質瘤的新型途徑,尋找特異性靶點是治療的關鍵。

miRNA通過與靶基因3’UTR區結合,降解靶基因mRNA或抑制翻譯,參與多種腫瘤細胞生物學活動[8]。miR-105-5p是近年來發現的與腫瘤發生發展密切相關的miRNA分子[9],已有研究發現miR-105-5p在非小細胞肺癌A549細胞中低表達,過表達miR-105-5p可抑制細胞增殖遷移及上皮間質轉化過程,并促進細胞凋亡,有望成為非小細胞肺癌的診斷標志物[10]。此外,miR-105-5p在胃癌細胞系中的過表達可導致PD-L1表達水平下降,并誘導CD8+共培養試驗中的T細胞活化,miR-105-5p有望成為免疫療法的治療靶點[9]。然而,miR-105-5p在膠質瘤中的研究極少。本研究結果表明,miR-105-5p在膠質瘤組織中表達水平降低,與Suo等[11]研究結果一致,且過表達miR-105-5p可抑制U251細胞活力、遷移細胞數以及CyclinDl、MMP-2、MMP-9蛋白水平,升高p21蛋白水平,表明過表達miR-105-5p可抑制U251細胞增殖、遷移提示miR-105-5p參與膠質瘤細胞行為學發展。

為了進一步明確miR-105-5p的下游調控機制,本研究通過生物信息學預測和熒光素酶實驗證實了CDC5L是miR-105-5p的直接靶點,且CDC5L表達水平與miR-105-5表達水平呈負相關,推測miR-105-5p可能負向靶向調控CDC5L發揮作用。CDC5L蛋白是調節細胞周期G2/M期轉變的必要蛋白,在部分人類體細胞腫瘤中發揮關鍵作用,CDC5L下調可導致染色體錯誤和有絲分裂停滯,從而降低癌細胞活力,被認為是腫瘤治療的潛在靶標[12,13]。研究顯示,CDC5L在膀胱癌組織中高表達,且與膀胱癌病理分級和Ki-67表達顯著相關,敲低CDC5L水平可抑制膀胱癌細胞增殖、遷移,誘導細胞凋亡[14]。本研究通過抑制CDC5L表達發現U251細胞的增殖和遷移能力降低,與Chen等研究一致[15],證實CDC5L可影響細胞增殖、遷移。為證實miR-105-5p通過調控CDC5L發揮作用,本研究在miR-105-5p表達的同時過表達CDC5L,發現CDC5L可逆轉miR-105-5p對膠質瘤細胞的調控作用,進一步證實過表達CDC5L可抑制過表達miR-105-5p對膠質瘤細胞的增殖、遷移抑制,同時減弱miR-105-5p對CyclinDl、MMP-2、MMP-9、p21蛋白的影響。

綜上所述,過表達miR-105-5p通過靶向下調CDC5L表達抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移。