響應面法優化苦膽草多糖脫色工藝

黃麗金 李自霖 陳貴元

摘要 為了確定過氧化氫法脫除苦膽草多糖中色素的最佳工藝，以多糖脫色率、多糖保留率2個指標的綜合評分為考查指標，在單因素試驗的基礎上，響應面優化過氧化氫法脫除苦膽草多糖中色素的工藝條件。結果表明，過氧化氫法色素最佳工藝為脫色溫度55 ℃，脫色時間209 min，過氧化氫體積分數2.73%，脫色1次。在該工藝條件下脫除色素，得到多糖脫色率為72.43%，多糖保留率為87.24%，綜合評分為79.8，與預測值80.08相比，誤差為0.3%?；貧w方程與實際情況擬合較好，表明該脫色工藝穩定可靠。

關鍵詞 苦膽草多糖；響應面法；過氧化氫；脫色工藝

中圖分類號 R283? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）09-0157-05

Abstract To determine the best process of removing pigment from Radix gentianae polysaccharide by hydrogen peroxide. Based on the single factor test， response surface method was used to optimize the process conditions for the removal of pigment from Radix gentianae polysaccharide by hydrogen peroxide. The results showed that the optimal process of the hydrogen peroxide method was decolorization temperature 55 ℃， decolorization time 209 min， hydrogen peroxide volume fraction 2.73%， and decolorization once. Depigmentation under the process conditions， the depigmentation rate of polysaccharide was 72.43%， the retention rate of polysaccharide was 87.24%， and the comprehensive score was 79.8， compared with the theoretical 80.08， the error was 0.3%. The regression equation fits well with the actual situation， indicating that the decolorization process is stable and reliable.

Keywords Radix gentianae polysaccharide; response surface method; hydrogen peroxide; depigmentation process

苦膽草（Radix gentianae），別名穿心蓮，屬爵床科一年生藥用植物，性寒、味苦，具有清熱解毒、抗炎止痛等功效，全草均可入藥，是一種傳統的中藥植物資源[1]，廣泛分布于福建、廣東、云南等地區[2]?？嗄懖莺卸嗵?、黃酮、多酚、內酯等多種活性成分[3-5]。苦膽草多糖的提取工藝和生物活性研究目前還鮮有報道[5-7]，苦膽草多糖脫色工藝的研究則尚未見報道。

多糖的提取方法眾多[8]，植物多糖多為水溶性分子，通常采用水作為溶劑進行浸提，提取多糖的同時常將水溶性色素浸提出來換入多糖中，使多糖顏色較深。色素的存在不僅干擾多糖的純度，還影響多糖的分離純化、結構分析以及生物活性等方面的研究[9]，因此有必要對多糖進行脫色處理。多糖的脫色方法主要有過氧化氫法、活性碳法以及大孔樹脂等，不同的脫色方法對脫色率、多糖保留率乃至多糖活性都有影響[10-13]。植物多糖含有的色素物質大多是水溶性的，且結構多以負離子形式存在[14]。過氧化氫的水溶液能夠電離出過氧氫根離子，能夠氧化水溶性色素負離子達到脫色效果，且對多糖的結構及活性破壞較小[15-16]?；诖?，本研究擬采用過氧化氫法脫除苦膽草多糖中的色素，響應面法優化脫色工藝，為苦膽草多糖分離純化、結構鑒定以及生物活性的研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦膽草購于大理市中藥材市場；葡萄糖標準品購自北京奧博星生物技術有限責任公司；蒽酮、濃硫酸、30%過氧化氫均為國產分析純（AR）。

1.2 主要儀器

BT-224S型電子分析天平（德國賽多利斯儀器公司），恒溫水浴鍋（上海博迅達實業有限公司），B600型低速離心機（上海醫用分析儀器廠），SP-722可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦膽草多糖的提取。工藝流程如下：苦膽草干粉→萃取回流→熱水浸提→濃縮→脫蛋白→乙醇沉淀→離心、洗滌→冷凍干燥→得到苦膽草多糖粗品。具體提取方法參考徐兵[7]文獻進行。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的制作。參照文獻[17]繪制葡萄糖標準曲線，稱取葡萄糖標準品100 mg，加蒸餾水定容至1 000 mL，得0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL標準液，加去離子水補至2 mL，在冰水浴中每管加入4 mL 0.5%的蒽酮濃硫酸試劑，混勻，沸水浴中加熱10 min，室溫靜置10 min。在620 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度（mg/mL）為X軸，吸光度（A）為Y軸，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.014 2X+0.011 5，R2=0.995 2，表明在0～0.06 mg/mL葡萄糖濃度范圍內，線性關系較好，表明該標準曲線可用于后續試驗葡萄糖濃度測定。

1.3.3 脫色率的測定。精密稱取0.6 g苦膽草多糖干粉，去離子水定溶至100 mL。取過濾多糖溶液使用紫外分光光度計進行全波長掃描，未得到合適的最大吸收峰值，由于溶液顏色為深褐色，按照溶液的互補色選取560 nm作為檢測波長[18]。過氧化氫對苦膽草多糖的脫色率按下列公式計算：

式中：D表示脫色率，%；A0為苦膽草多糖溶液過氧化氫脫色前在560 nm 處的吸光度；A1為苦膽草多糖溶液過氧化氫脫色后在560 nm處的吸光度。

1.3.4 多糖保留率的測定。參照文獻[17]的方法，在波長620 nm處測定吸光度，利用葡萄糖標準曲線計算多糖質量濃度。代入下式計算多糖的保留率：

式中：R表示多糖保留率，%；C1為過氧化氫脫色后苦膽草多糖質量濃度，mg/mL；C0為過氧化氫脫色前苦膽草多糖質量濃度，mg/mL。

1.3.5 脫色效果評價。采用綜合加權評分法[19]評價苦膽草多糖的脫色效果，將多糖脫色率（D）和多糖保留率（R）兩者的權重值均設為50，總分計算為100分，其綜合評分按照下列公式計算：

式中：M表示多糖脫色率和多糖保留率的綜合評分，分；D表示脫色率，%；Dmax表示脫色率的最大值，%；R表示多糖保留率，%；Rmax表示多糖保留率的最大值，%。

1.3.6 單因素試驗。在固定脫色溫度50 ℃、脫色時間3 h、過氧化氫體積分數3%、脫色1次的基礎上，進行單因素試驗，分別考察脫色溫度、脫色時間、過氧化氫體積分數3個因素對多糖脫色率和保留率的影響。

1.3.7 響應面試驗設計。在單因素試驗基礎上，選取脫色溫度（A）、脫色時間（B）、過氧化氫體積分數（C）為考察因素，以多糖脫色率和多糖保留率的綜合評分（Y）為考察指標，采用3因素3水平響應面試驗法優化苦膽草多糖的脫色工藝。因素水平見表1。

1.4 數據處理

每個試驗均重復3次，采用Design Expert 10.0、Excel 2010、Origin 9.0等軟件對數據進行統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.2 單因素試驗

2.2.1 脫色溫度對多糖脫色率和多糖保留率的影響。如圖1可知，在30～70 ℃范圍內，隨著溫度的升高，多糖脫色率不斷增加，多糖保留率則不斷下降?？赡苁请S著溫度的升高，過氧化氫氧化色素的能力不斷增強，但是溫度過高可能會引起多糖水解，導致多糖損失較大。當脫色溫度低于50 ℃時，多糖保留率較高，但脫色率低；當溫度超過50 ℃，脫色率急驟升高，但多糖保留率則顯著下降。在脫色溫度為50 ℃時，多糖脫色率為64.77%，多糖保留率為85.82%，兩者都得到兼顧，因此選擇50 ℃作為脫色溫度開展后續單因素試驗。綜合考慮，選擇脫色溫度40、50、60 ℃進行響應面試驗。

2.2.2 過氧化氫體積分數對多糖脫色率和多糖保留率的影響。由圖2可知，隨著過氧化氫用量的增加，脫色率不斷地增加，多糖保留率不斷下降，在過氧化氫體積分數小于3%，脫色率大幅度增加，過氧化氫體積分數大于3%之后多糖脫色率上升緩慢，可能是過氧化氫與色素的結合達到飽和狀態。與此同時，隨著過氧化氫體積份數的增加，多糖保留率不斷降低，可能是過氧化氫的強氧化性破壞多糖結構，導致多糖損失。在過氧化氫體積分數為3%時，多糖脫色率為67.73%，多糖保留率為83.39%。為避免多糖過多的損失以及保證脫色效果，選取過氧化氫體積分數3%開展后續單因素試驗。綜合考慮，選擇過氧化氫體積分數2%、3%、4%開展響應面試驗。

2.2.3 脫色時間對多糖脫色率和多糖保留率的影響。如圖3可知，隨著時間的延長，脫色率不斷增加，多糖保留率則不斷下降。脫色時間小于3 h，脫色率增加顯著，在超過3 h之后，脫色率增加趨緩。這可能是過氧化氫與色素分子的結合會出現飽和狀態，所以脫色一定時間后，脫色率就會逐漸趨緩。隨著過氧化氫脫色作用時間的增加，過氧化氫也會氧化破壞多糖分子，造成多糖損失。因此考慮時間成本以及多糖的保留率，選擇脫色時間為2、3、4 h進行響應面試驗。

2.3 響應面試驗結果

響應面試驗結果見表2，方差分析結果見表3。采用Design Expert 10.0軟件分析表2中的試驗數據，得到綜合評分（Y）與脫色溫度（A）、脫色時間（B）、過氧化氫體積分數（C）的相關性擬合方程：Y=77.93+4.76A+2.50B+0.30C+0.28AB+0.78AC+0.49BC-2.89A2-1.71B2-0.70C2。

由表3可知：該模型的P<0.01，表明該回歸方程極顯著，提示試驗設計可靠。失擬項P值為0.422 1 P>0.05，提示該回歸方程擬合度較好。脫色溫度（A）、脫色時間（B）以及脫色溫度的二次項（A2）對多糖脫色的綜合評分具有極顯著影響（P<0.01）；脫色時間的二次項（B2）對多糖脫色的綜合評分具有顯著影響（P<0.05），提示改變這些因素的條件會使響應值（綜合評分）產生顯著變化?；貧w方程的交互項AB、AC、BC的P>0.05，表明各交互項對綜合評分的影響不顯著，提示3個因素無交互作用。

根據表3中F值的大小，提示各因素對響應值（綜合評分）的影響強弱為脫色溫度（A）>脫色時間（B）>過氧化氫體積分數（C）。其中脫色溫度對響應值的影響最大。模型R2=0.968 6，R2Adj=0.928 2，均大于0.9，表明該模型預測值與實測值較為接近，表明該模型能很好地模擬真實的試驗過程。

2.4 驗證試驗

根據軟件Design-Expert 10.0預測的最優脫色工藝條件為：脫色溫度54.63 ℃，脫色時間208.53 min，過氧化氫體積分數為2.73%。多糖脫色率的理論預測值為70.11%，多糖保留率為90.04，綜合評分為80.08。為了便于實際操作，將各因素修正為：脫色溫度55 ℃，脫色時間209 min，過氧化氫體積分數為2.73%，脫色1次。在該工藝條件，進行3次平行試驗，取均值，得到多糖脫色率為72.43%，多糖保留率為87.24%，綜合評分為79.84，與預測值80.08相比，誤差為0.3%，表明該脫色工藝穩定可靠，可用于苦膽草多糖色素的脫除。

3 結論

過氧化氫方法脫色素具有操作簡便、脫色率高的優勢，適用于脫除帶負電荷的水溶性色素[14]。本研究通過過氧化氫法對苦膽草多糖進行響應面脫色試驗，以多糖脫色率和多糖保留率2個指標確定了單因素試驗中脫色溫度、脫色時間、過氧化氫用量的最佳參數。在單因素試驗基礎上，響應面試驗優化苦膽草多糖過氧化氫脫色工藝，得到最佳脫色工藝為：脫色溫度55 ℃，脫色時間209 min，過氧化氫體積分數為2.73%，脫色1次。在此條件下，多糖脫色率達到72.43%，多糖保留率為87.24%，綜合評分為79.8。表明該工藝穩定可靠、操作簡單，適用于工業化生產中苦膽草多糖色素的脫除。

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（責編：張宏民）

基金項目 國家自然科學基金項目（31860252）；云南省自然科學基金高校聯合面上項目（2017FH001-084）；云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室開放項目（AG2022006）。

作者簡介 黃麗金（1998—），女，福建上杭人，在讀碩士。研究方向：植物多糖分離提取及功能。