茶樹CsNCED2 啟動子互作轉錄因子篩選及在非生物脅迫中的響應

李佳思，劉迎慶，張永恒，張迎澳，肖燁子，劉露，余有本

西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100

脫落酸（Abscisic acid，ABA）是一種重要的植物激素，在植物種子休眠、萌發、生長、開花、果實成熟等生理活動中發揮關鍵作用[1-5]。同時，ABA 也是植物中的關鍵抗逆因子，參與了植物對多種逆境脅迫的響應過程，如植物在遭受干旱[6]、低溫[7]、鹽害[8]、病害[9]等脅迫時，植物體內會迅速積累ABA，從而誘導一系列依賴于 ABA 信號的抗逆基因上調表達，引起植物抗逆性的增加[10]。近年來，大量的研究揭示了植物體內ABA 的合成途徑，其中，9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）被鑒定為ABA 合成過程中的關鍵限速酶，它的表達往往受到逆境脅迫誘導并與植物抗逆性相關[11-12]。水稻中的研究表明，干旱脅迫能誘導OsNCED5的表達，從而促進ABA 合成，增加了水稻的抗旱性[13]。而抑制GhNCED1會導致棉花體內的ABA 含量降低，增加了棉花對干旱和鹽脅迫的敏感度[12]。

研究表明，轉錄因子可以介導脅迫所誘導的NCED轉錄水平變化，一些轉錄因子通過激活NCED的表達來增加植物的抗逆性，也有一些轉錄因子通過抑制其表達從而降低植物的抗逆性。例如，擬南芥AtWRKY57 通過結合到AtNCED3的啟動子并激活其表達，促進ABA 的積累，提高擬南芥的抗旱性[14]。在鹽脅迫下，水稻OsERF19 可以通過激活OsNCED5的表達，進而影響水稻體內的ABA 含量和耐鹽性[15]。番茄中，bHLH 類轉錄因子SlBZR1通過直接激活SlNCED1的表達來增加番茄中的ABA 含量以提升番茄的抗寒能力[16]。也有一些轉錄因子通過抑制NCED的表達從而在植物應對逆境脅迫過程中發揮負面作用，如水稻OsWRKY67 能抑制OsNCED3和OsNCED4的表達，過量表達OsWRKY67，導致水稻的抗旱性降低[17]。

茶樹中鑒定了5 個NCED基因，它們的表達量在茶葉加工過程中會發生顯著變化[18-19]。此外，茶樹NCED成員在茶樹對低溫[20]和干旱脅迫[21-22]的響應過程中也發揮著重要作用，但茶樹中NCED響應脅迫條件的轉錄調控機制還有待進一步研究。 本研究通過對CsNCED2上游調控因子進行挖掘，并探究它們在不同脅迫下的表達模式，以期為進一步了解CsNCED2響應脅迫的轉錄機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法

試驗材料為一年生龍井長葉無性系水培苗，培養于西北農林科技大學科研溫室。培養條件為白天25 ℃，晚上22 ℃，自然光照；選取健康且長勢一致的茶苗進行不同脅迫處理。鹽、干旱處理：將茶苗根部用水洗凈后移入配制好的NaCl（200 mmol·L-1）和20% PEG 6000溶液中分別進行高鹽和干旱脅迫；低溫處理：使用光照培養箱進行4 ℃低溫脅迫。3 個處理均在處理后0、1、4、6、8、12、24、48 h 剪取幼嫩葉片，用液氮快速冷凍后保存于-80 ℃冰箱用于提取RNA，每個時間點的樣品均設置3 個生物學重復。

1.2 酵母單雜交文庫篩選

用課題組前期克隆的CsNCED2的啟動子做模板，將-836 至-1415 區域構建至pABAi載體上獲得誘餌載體（引物見表1）。用限制性內切酶BstbI線性化誘餌載體并轉化至Y1HGold 酵母中，涂布于SD/-Ura 培養基，30 ℃培養 3 d。挑取單克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 進行菌落PCR 鑒定，獲得誘餌菌株 Y1H-pAbAi-proCsNCED2。取適量Y1H-pAbAi-proCsNCED2涂布于含有不同金擔子素A（Aureobasidin A，AbA）濃度的SD/-Ura 培養基上，30 ℃倒置培養3 d，觀察菌落的生長情況，以確定能夠完全抑制Y1H-pAbAi-proCsNCED2自激活的 AbA 濃度。按照SK2400 經典酵母轉化試劑盒（酷來搏，北京）說明書制作Y1H-pAbAi-proCsNCED2感受態細胞，并轉化本實驗室前期構建的茶樹葉片文庫質粒，轉化后的菌涂布于 SD/-Leu（100 ng·mL-1AbA）培養基上，30 ℃倒置培養3 d 后，挑取單克隆進行PCR 擴增，并對PCR 產物進行測序鑒定。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 酵母單雜交點對點驗證互作蛋白

測序信息提交到NCBI 進行BLASTx 比對后，根據候選轉錄因子CsDof5.4（GenBank登錄號XP_028116390.1） 和CsERF38（GenBank 登錄號XP_028084536.1）序列信息設計特異引物（表1），以龍井長葉cDNA為模板將它們的編碼序列（CDS）構建至pGADT7(AD)載體上，形成 AD-Dof5.4 和AD-ERF38重組載體，并轉化至Y1H-pAbAi-proCsNCED2感受態細胞中，涂布于SD/-Leu（100 ng·mL-1AbA）培養基上，30 ℃培養3 d，觀察菌斑生長狀況，AD 空載體轉化Y1H-pAbAi-proNCED2菌株為陰性對照。

1.4 轉錄活性鑒定

設計特異引物（表 1）將CsDof5.4與CsERF38的CDS 序列構建至pGBKT7(BD)載體，獲得BD-Dof5.4 與BD-ERF38 重組載體，并將它們分別轉化入Y2HGold 酵母感受態細胞中，涂布于SD/-Trp 培養基，30 ℃培養3 d，將長出的單克隆轉移至SD/-Trp-His-Ade(X-a-gal)培養基上，30 ℃條件下進行培養，觀察它們的生長狀態及顏色變化。轉化有BD 空載體的Y2HGold 酵母菌作為陰性對照。

1.5 亞細胞定位分析

設計特異引物（表1）構建35S::CsDof5.4-GFP 和35S::CsERF38-GFP 用于亞細胞定位試驗。將35S::CsDof5.4-GFP、35S::CsERF38-GFP 和35S::GFP 分別轉化至根癌農桿菌GV3101 中，在28 ℃分別培養至渾濁后，3 000 r·min-1離心5 min，棄去培養基，用侵染液（10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，120 μmol·L-1AS，pH=5.7）分別重懸菌體至OD600為0.8 后注射到煙草葉片中，48 h后使用熒光顯微鏡BX63（奧林巴斯，日本）對注射區域進行GFP 信號的觀察。

1.6 雙熒光素酶（Dual-LUC）試驗

用實驗室前期保存含有的CsNCED2pro::LUC 的GV3101（pSoup）作為報告菌株，轉化有 35S::CsDof5.4-GFP、35S::CsERF38-GFP 和35S::GFP 的根癌農桿菌GV3101 作為效應菌株。用侵染液分別將它們的OD600調整至0.8，報告菌株和相應的效應菌株按照體積比為1∶1 的比例混勻后注射至煙草葉片中，注射48h后按照Double-Luciferase Reporter Assay Kit（全式金，北京）試劑盒說明書進行螢火蟲熒光素酶（LUC）和海腎螢光素酶（REN）活性測定。

1.7 RNA 提取和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

茶樹RNA 提取根據多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）說明書進行。根據CsNCED2，CsDof5.4和CsERF38基因序列信息設計特異定量引物（表1）用于 qRT-PCR試驗，茶樹GADPH基因作為內參基因（TEA003029）。使用 ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（諾維贊，南京）在Lightcycler480Ⅱ型定量 PCR 儀進行qRT-PCR。設置3 個生物學重復，用法計算基因的相對表達量，并利用 GraphPad Prism 8 作圖。

1.8 數據統計與分析

用Excel 軟件進行數據統計，IBM SPSS 19 軟件進行Student’st檢驗，P≤0.05 被認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 CsNCED2 啟動子互作蛋白篩選

誘餌載體pAbAi-proNCED2用限制性內切酶BstbⅠ線性化后轉化Y1HGold 酵母感受態細胞，涂布于SD/-Ura 培養基上30 ℃培養3 d，挑取單菌落進行 PCR 鑒定，獲得Y1H-pAbAi-proCsNCED2誘餌菌株，將其涂布于SD/-Ura 培養基上，AbA 質量濃度分別為0、50、100、150 ng·mL-1。結果顯示，誘餌菌株在不含AbA 的SD/-Ura 培養基上生長良好（圖1A），而在含50 ng·mL-1AbA 的SD/-Ura培養基上不能生長（圖1B），因此選擇質量濃度為50 ng·mL-1的AbA 作為CsNCED2啟動子酵母單雜交的工作濃度。文庫質粒轉化至誘餌菌株后，篩選到17 個單克隆能在50 ng·mL-1AbA 的SD/-Leu 培養基上生長（圖1C），對它們分別進行菌落PCR 鑒定后得到16 個條帶大小為1 000～2 000 bp 的PCR 產物（圖1D）。

圖1 CsNCED2 啟動子酵母單雜交文庫篩選結果Fig. 1 Yeast single hybrid library screening results of CsNECD2 promoter

2.2 EST 序列的功能注釋

將16 個PCR 產物測序得到的EST 序列提交到NCBI 網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST 比對和注釋，如表2 所示，多個EST 編碼的蛋白參與脅迫響應過程，如與植物病蟲害免疫相關的 GDSL 酯酶/脂肪酶[23]（EST5），與干旱、鹽脅迫相關的水通道蛋白[24]（EST11），脫落酸、脅迫、成熟誘導蛋白ASR[25]（EST10）和甘油-3-磷酸酰基轉移酶[26]（EST13）等。同時，EST6 被注釋為AP2/ERF轉錄因子，EST15 被注釋為Dof 轉錄因子，說明它們可能直接參與了CsNCED2的轉錄調控。根據他們與其他植物的同源蛋白的進化關系（圖2）將它們分別命名為 CsERF38 和CsDof5.4。

表2 EST 序列對比結果Table 2 Comparison of EST sequence

圖2 轉錄因子進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of transcription factors

2.3 CsDof5.4 和CsERF38 轉錄激活鑒定和亞細胞定位分析

CsDof5.4和CsERF38的CDS 構建至BD載體上用于轉錄活性分析，結果如圖3A 所示，在 SD/-Trp-His-Ade(X-a-gal)培養基上轉化有BD 空載體的Y2HGold 菌株不能生長，而轉化有BD-CsDof5.4和BD-CsERF38的Y2HGold能激活報告基因HIS3、ADE2和MEL1的表達，從而正常生長并顯示藍色，說明CsDof5.4和CsERF38均具有轉錄激活的作用。煙草葉片中的亞細胞定位顯示 35S::CsDof5.4-GFP 和35S::CsERF38-GFP 的熒光均只在細胞核中觀察到，說明CsDof5.4和CsERF38均定位于細胞核（圖3B）。

圖3 CsDof5.4 和CsERF38 的轉錄活性鑒定和亞細胞定位分析Fig. 3 Transcriptional activity identification and subcellular localization analysis of CsDof5.4 and CsERF38

2.4 CsDof5.4 和CsERF38 對CsNCED2 的表達調控

為了進一步分析CsDof5.4 和CsERF38 與CsNCED2啟動子結合情況，將CsDof5.4和CsERF38的全長CDS 分別構建至AD 載體并轉化至誘餌菌株進行驗證。如圖4A 所示，轉化有 AD-ERF38 和 AD-Dof5.4 的菌株在SD/-Leu（100 ng·mL-1AbA）培養基上能正常生長，而轉化AD 空載體質粒的菌株則不能，說明CsDof5.4 和CsERF38 能結合CsNCED2的啟動子。同時，在煙草葉片進行熒光素酶試驗來驗證CsDof5.4 和CsERF38 對CsNCED2表達的調控，結果如圖4B 所示，在煙草葉片中表達CsDof5.4 和CsERF38 都顯著增強了CsNCED2啟動子驅動的 LUC 信號，說明CsDof5.4 和CsERF38 都能激活CsNCED2的表達。

圖4 酵母單雜交驗證CsDof5.4 和CsERF38 與CsNCED2 啟動子結合Fig. 4 Y1H verification of CsDof5.4 and CsERF38 binding to CsNCED2 promoter

2.5 CsNCED2、CsERF38 和CsDof5.4 在脅迫下的表達分析

利用qRT-PCR 分別檢測了CsNCED2、CsERF38和CsDof5.4對鹽、干旱和低溫脅迫的響應，結果如圖5 所示，CsNCED2的表達量在鹽脅迫和干旱脅迫下上升，而在低溫處理下沒有顯著變化。同樣地，鹽脅迫和干旱脅迫也誘導了CsERF38的表達，且在鹽脅迫和干旱脅迫下CsERF38表達水平的變化趨勢與CsNCED2表達水平的變化趨勢相關性分別為0.79 和0.77。CsDof5.4的表達水平不受干旱脅迫和低溫脅迫的影響，但在鹽脅迫下逐漸上升，且在鹽脅迫下CsDof5.4表達水平的變化趨勢與CsNCED2表達水平的變化趨勢相關性高達0.85。

圖5 鹽、干旱和低溫脅迫下的表型及CsNCED2，CsERF38 和CsDof5.4 的表達分析Fig. 5 Phenotype and expression analysis of CsNCED2, CsERF38 and CsDof5.4 under salt, drought and low temperature stresses

3 討論

酵母單雜交技術庫篩文選能高效的鑒定到與目的基因啟動子互作的轉錄因子，因此被廣泛運用到葡萄[27]、香蕉[28]、桃[29]等多種植物的研究中。本研究通過酵母單雜交技術鑒定到CsERF38 和CsDof5.4 能結合CsNCED2的啟動子，同時，通過CsERF38 和CsDof5.4 的亞細胞定位分析、轉錄活性鑒定及在煙草中的熒光素酶試驗進一步證實了 CsERF38 和CsDof5.4 可以直接激活CsNCED2的表達，表明它們在茶樹在CsNCED2轉錄調控中發揮重要作用。

NCED基因的表達能響應逆境脅迫并調控內源ABA 的含量水平，從而提高植物的抗性[30-31]。同樣地，茶樹中的研究發現，ABA含量在干旱脅迫下快速上升，導致氣孔關閉以減少水分散失[22]；Wan 等[32]研究表明，ABA信號在茶樹對鹽脅迫響應過程中也發揮重要作用。本研究發現，CsNCED2的表達量在干旱和鹽脅迫下上升，表明它在茶樹中參與了干旱和鹽脅迫導致的ABA 積累過程。另外，Ni等[33]研究表明低溫脅迫增強了茶樹葉片中ABA 的合成過程，王贊等[20]的研究證實了1個茶樹NCED基因參與了低溫誘導的ABA 合成過程，而本研究結果表明CsNCED2的表達不受低溫脅迫誘導。綜上所述，茶樹不同NCED基因成員在響應脅迫過程存在差異，CsNCED2主要參與了茶樹對干旱和鹽脅迫的響應過程。

已有大量研究表明，植物中的轉錄因子通過調控NCED的表達來響應脅迫環境[34-35]。本研究證實，CsERF38和CsDof5.4參與了茶樹對鹽脅迫的響應過程，同時CsERF38參與了茶樹對干旱脅迫的響應過程。盡管它們在茶樹響應鹽脅迫和干旱脅迫過程中的具體功能還需進一步驗證，但CsERF38和CsDof5.4在鹽脅迫下與CsNCED2的表達高度相關，同時，CsERF38的表達在干旱脅迫下與CsNCED2也高度相關，結合它們對CsNCED2表達的激活作用，我們推測 CsERF38 能通過調控CsNCED2的轉錄從而參與茶樹對鹽脅迫和干旱脅迫的響應過程，而CsDof5.4 能通過調控CsNCED2的轉錄參與茶樹對鹽脅迫的響應過程。本研究結果為茶樹中CsNCED2響應鹽脅迫和干旱脅迫的轉錄調控機制研究奠定了一定的理論基礎。