推拿對坐骨神經慢性壓迫性損傷模型鼠脊髓背角膠質纖維酸性蛋白和N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基表達的影響

官乾 劉志鳳 于天源 王厚融 張英琦 徐亞靜 楊震杰 薩出拉 張潤龍 陳金平

神經病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是由軀體感覺神經系統的損傷或疾病導致的疼痛,是一種臨床常見、多發的慢性疼痛[1]。NPP的慢性維持與外周、中樞敏化介導的機械痛、自發性疼痛導致的中樞突觸可塑性改變相關。突觸可塑性是指神經元突觸在受到損傷刺激時,其結構和功能發生相應變化的能力。脊髓背角突觸可塑性的改變是參與NPP痛覺傳遞和維持的重要機制[2]。基礎研究證實NPP發生后,會誘導脊髓背角神經元傳遞機械性痛覺超敏反應,導致中樞敏化,表現為突觸可塑性的改變。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體調節神經元的樹突、軸突結構發育及參與突觸可塑性的形成。脊髓背角含有NMDA受體2B亞基(NR2B),其變化會改變突觸結構和功能的可塑性,從而影響動物行為。因此NR2B是NPP模型大鼠脊髓背角突觸可塑性變化的重要調節因子。星形膠質細胞是神經系統中數量最多、分布最廣的神經膠質細胞,其活化的標志物是神經膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。經研究證實,星形膠質細胞的也在NPP中發揮重要作用[3]。

前期研究顯示,三法三穴可以改善神經損傷大鼠的行為學表現,改善坐骨神經損傷大鼠的痛覺敏感程度;三法三穴還能改善大鼠的坐骨神經損傷點、脊髓腹角和腓腸肌等超微結構,促進周圍神經損傷導致的感覺和運動功能恢復,提高突觸傳遞效率,抑制痛覺敏化,促進感覺功能和運動功能的恢復[4-5]。本研究建立坐骨神經慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)模型,通過機械縮足反射閾值和累積疼痛評分評價機械痛敏反應和自發性疼痛的恢復情況,通過透射電鏡觀察脊髓背角形態變化,通過免疫熒光觀察推拿對CCI大鼠脊髓背角GFAP、NR2B表達的影響。探討推拿鎮痛與脊髓背角突觸可塑性變化和星形膠質細胞的關系,為臨床治療NPP提供客觀的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

雄性SD大鼠,45只,體質量(200±10)g,購自于斯貝福(北京)生物科技有限公司,飼養在北京中醫藥大學動物房內,3只/籠,環境溫度(25±1)℃,相對濕度(50±5)%,晝夜節律,自由飲食,每周更換兩次墊料。適應性飼養1周,經電子測痛儀(BIO-EVF5)檢測后篩選出痛閾均一的大鼠36只。所有操作遵循北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會相關規定(審批號:BUCM-4-2020111103-4087)。

1.2 主要儀器與試劑

儀器:按摩推拿手法模擬儀(專利號200710187403.1),VonFrey電子測痛儀(BIO-EVF5,生產廠家BIOSEB),超薄切片機(Leica),鉆石切片刀(Daitome),透射電子顯微鏡(hitachi),150目方華膜銅網,Olypums顯微鏡。

試劑:電鏡固定液(Servicebio,G1102),無水乙醇(100092183)、丙酮(國藥集團化學試劑有限公司,10000418),812包埋劑(SPI,90529-77-4),鋨酸(Ted Pella Inc),NR2B抗體、羊抗兔二抗AlexaFluor 594、羊抗小鼠AlexaFluor 488(Bioss),GFAP抗體(Elabscience),DAPI染液。

1.3 模型制備

利用隨機數字表制定隨機分組方案,將36只大鼠分為假手術組、模型組、推拿組,每組12只。

結合預實驗并參照前人所述方法[6-8],制備minor CCI模型模擬臨床NPP,模型組、推拿組大鼠均選取右側后肢進行造模,并于造模前12小時和造模后12小時禁食、禁水。模型組、推拿組造模:用1%的戊巴比妥鈉(0.35 mL/100 g)對大鼠進行腹腔麻醉;待充分麻醉后,將大鼠俯臥位固定;于右側坐骨結節下,橫向開口1 cm,鈍性分離皮下組織和肌肉,然后分離并暴露出坐骨神經,于坐骨神經分叉前7 mm,將一根4～0鉻制羊腸線用生理鹽水浸潤后在坐骨神經分叉處前端進行結扎,然后用手術縫合線逐層縫合皮膚;術后碘伏棉球再次消毒,在傷口上均勻撒上消炎藥以預防術后傷口感染。假手術組造模:僅分離右側坐骨神經,不做結扎,其他步驟同模型組。

1.4 實驗方法

假手術組與模型組:常規喂養,每日抓握束縛9分鐘,無推拿干預。推拿組:造模后第7天開始干預。用按摩推拿手法模擬儀(專利號:200710187403.1)依次刺激大鼠右側殷門、陽陵泉、承山穴;依次施行點法、撥法、揉法[7];參數設置:力度為4N,頻率為60次/分鐘,每個穴位施術1分鐘,共9分鐘。治療次數為20次,每10次休息1次。

1.5 行為學檢測

分別于造模前、干預第0天、干預后第10天、第20天進行測量。每只大鼠測量3次取平均值。

1.5.1 機械縮足反射閾值(paw mechanical withdraw threshold,PMWT) 采用PMWT評價大鼠痛覺過敏程度。將各組大鼠置于有機玻璃箱中,限定其活動區域,箱底放置網格鐵絲網,待其適應環境安靜后,用VonFrey電子測痛儀的探頭刺激大鼠右側足底皮膚,維持5秒左右,每次刺激至少間隔10分鐘,刺激后觀察大鼠反應,當大鼠出現明顯的縮足、舔足動作時,停止操作,此時記錄電子測痛儀數值,即為PMWT。

1.5.2 累計疼痛評分(cumulated pain score,CPS) 采用CPS評定疼痛強度。將大鼠放于開闊場地評定,后爪不著地,計2分;著地但不負重,計1分;著地并且負重,計0分。若大鼠的后爪被壓迫發白,表示負重。每5分鐘觀察1次,以術側足評分減去對側足評分即得累積疼痛評分。

1.6 形態學觀察

干預第20次后取材,取材部位為患側L4～L6節段脊髓背角。用1%戊巴比妥鈉(0.35 mL/100 g)對大鼠進行腹腔麻醉;然后對大鼠進行灌注,灌注后的脊髓用1%鋨酸避光室溫固定2小時;用0.1 M磷酸緩沖液PBS漂洗3次,每次15分鐘;丙酮脫水、滲透;包埋劑包埋,用Leica超薄切片機切片60～80 nm,150目方華膜銅網撈片;鉛染色后,于透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

1.7 免疫熒光染色

脊髓沉糖脫水后,用OCT包埋劑對脊髓腰膨大組織包埋,切片厚度30 μm,將切片放置于24孔板的山羊血清中封閉,過夜,次日吸去山羊血清,用PBS漂洗三遍,然后加入NR2B一抗和GFAP一抗(1∶200)一抗共同標記星型膠質細胞,置于搖床上孵育6小時,用PBST洗3遍;然后加羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗(1∶500),避光,搖床兩小時,洗3遍;DAPI細胞核染色,常溫10分鐘,用PBS漂洗1次,展片,封片,4℃冰箱保存,所制切片于Olypums顯微鏡200倍下觀察并拍照取樣。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠行為學檢測結果

2.1.1 PMWT結果 造模7天后,即干預第0天,與假手術組比較比較,模型組與推拿組大鼠PMWT結果顯著降低(P<0.01),表明模型制備成功。干預10天后,與假手術組相比,模型組大鼠PMWT結果顯著降低(P<0.01);與模型組相比,推拿組PMWT結果顯著升高(P<0.01)。干預20天后,與假手術組比較,模型組PMWT結果顯著降低(P<0.01);與模型組比較,推拿組PMWT結果顯著升高(P<0.01),但仍低于假手術組,且逐漸趨向造模前的閾值,表明推拿可以顯著增加大鼠機械縮足反射閾值,恢復至正常狀態,抑制痛覺敏化。見表1。

表1 各組大鼠機械縮足反射閾值比較

2.1.2 CPS結果 造模7天后,即干預第0天,與假手術組比較,模型組和推拿組大鼠CPS顯著升高(P<0.05或P<0.01),說明造模后,大鼠感覺功能受到影響,疼痛強度增加,造模成功;推拿干預10天后,與假手術組相比,模型組CPS結果顯著升高(P<0.01);與模型組相比,推拿組CPS顯著降低(P<0.05);推拿干預20天后,與假手術組相比,模型組CPS結果顯著升高(P<0.01);與模型組相比,推拿組CPS顯著降低(P<0.01),與干預10天后比較有下降趨勢,但仍高于假手術組,說明推拿可減輕大鼠疼痛強度,抑制痛覺敏化,促進大鼠感覺功能的恢復。見表2。

表2 各組大鼠累計疼痛評分比較秒)

2.2 形態學檢測結果

假手術組:脊髓背角細胞器基本完整、排列有序,線粒體大小及形態基本正常,但細胞器數量相對少,突觸主要為直型突觸。模型組:該突觸為對稱性突觸,超微結構損傷較明顯,膜結構模糊、溶解,基質水腫、變淡,微絲、微管稀疏,線粒體(M)大多腫脹,膜局部破損,膜內基質局部變淡,嵴減少。軸突終末(T)細胞膜不完整,突觸前膜(PM)蛋白聚集,致密區較短,突觸小泡(SV)數量較少,個別存在,大多破損。樹突棘(DS)基質溶解,大面積水腫區,突觸后膜(PD)致密區較短、較薄,突觸間隙(SC)尚可。推拿組:該突觸為對稱性突觸,超微結構損傷相對較輕,膜結構完整,基質水腫、變淡,微絲、微管稀疏,線粒體(M)輕度腫脹,膜局部破損,嵴存在。軸突終末(T)細胞膜完整,突觸前膜(PM)蛋白聚集,致密區較長,突觸小泡(SV)數量較多,少量破損。樹突棘(DS)基質溶解,大面積水腫區,突觸后膜(PD)致密區較長、較薄,突觸間隙(SC)尚可。見圖1。

注:A～C為假手術組;D～F為模型組;G～I為推拿組。

2.3 免疫熒光染色

2.3.1 各組大鼠脊髓背角GFAP表達比較 干預20天后,與假手術組相比,模型組脊髓背角星型膠質細胞呈完全或部分活化狀態,部分胞體增大,模型組GFAP免疫熒光強度顯著增強(P<0.05);與模型組相比,推拿組脊髓背角星型膠質細胞呈未活化或部分活化狀態,推拿組脊髓背角GFAP表達均明顯低于模型組(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠脊髓背角GFAP、NR2B表達(免疫熒光,50 μm)

表3 各組大鼠脊髓背角GFAP、NR2B平均熒光強度比較

2.3.2 各組大鼠脊髓背角NR2B表達比較 干預20天后,與假手術組比較,模型組大鼠脊髓背角NR2B免疫熒光強度明顯增強(P<0.05),說明造模成功。與模型組比較,推拿組大鼠脊髓背角平均熒光強度顯著降低,說明推拿可顯著降低脊髓背角NR2B的表達(P<0.05)。見表3、圖2。

3 討論

3.1 CCI模型可模擬臨床NPP

周圍神經損傷后,傷害性信息傳入脊髓,脊髓背角的突觸會發生可塑性變化,包括突觸形態和密度的變化等,是NPP產生痛覺過敏和觸誘發痛的病理基礎[8-10]。CCI模型的疼痛特征和NPP十分相似,可表現出自發痛、觸發痛等痛覺過敏[8]。實驗研究表明CCI大鼠出現機械痛覺過敏反應時,傷害性刺激傳入脊髓背角,會引起突觸形態的改變,加快突觸信息的傳遞,引起痛覺過敏[9]。本研究中,結合行為學和形態學結果,造模后7天大鼠機械痛閾較假手術組降低,累計疼痛評分較假手術組增加;超微結構顯示模型組較假手術組損傷明顯,表明CCI模型制備成功。

3.2 推拿治療NPP作用顯著

推拿作為一種極具特色的中醫外治法,它通過點法、撥法、揉法等多種手法作用于患者局部,以達到舒筋通絡、理筋整復、滑利關節的作用,從而緩解疼痛、治療疾病。本研究選取三法三穴作為干預手法,能達到刺激穴位-神經-肌肉區域的最大刺激量[10-11]。課題組前期已進行了初步探索,證明三法三穴能改善CCI大鼠的行為學表現,緩解自發性疼痛、機械痛覺異常,抑制痛覺過敏;三法三穴還可以明顯促進超微結構的修復和再生,促進感覺和運動功能的恢復[12-13]。本研究證實了推拿干預可以提高大鼠機械痛閾值、降低疼痛強度,還可以改變脊髓背角突觸的形態結構,從而影響突觸可塑性來抑制痛覺敏化。

3.3 突觸可塑性的改變可反應推拿干預對痛覺敏化的影響

突觸是神經元可塑性的敏感部位,其可塑性包括形態結構和功能的改變,形態結構表現為突觸活性區數量與結構的改變等。突觸介導神經環路相鄰神經元間的信息傳遞,從而影響神經系統所支配的行為,如感覺功能和運動功能[16]。CCI大鼠出現機械痛覺過敏反應時,其脊髓Ⅱ層突觸界面曲率增大,凹型突觸顯著增加且線粒體腫脹、數量增多,線粒體多少與突觸功能活動狀態相關,凹型突觸界面呈“袋狀”,可增加突觸界面曲率,提高突觸傳遞的效能,加快神經信息傳遞,引起痛覺過敏[14]。本研究結果顯示,模型組脊髓背角超微結構損傷明顯,膜界限不清,線粒體腫脹,嵴減少,突觸致密區變短;經過推拿干預后,破損結構逐漸恢復,趨完整態,膜界限清晰,線粒體腫脹程度較輕,嵴存在,突觸致密區變長,逐漸趨向正常狀態。證明推拿可以使脊髓背角結構逐漸恢復,突觸可塑性改變,突觸傳遞效能降低,疼痛逐漸緩解。

3.4 推拿可通過抑制星型膠質細胞活化和神經遞質的釋放來鎮痛

脊髓背角膠質細胞與周圍神經損傷引起的NPP關系密切[15]。GFAP是星形膠質細胞的一種標志性蛋白,它可以維持星形膠質細胞形態的正常穩定、促進星形膠質細胞突起生長與延長[16]。NMDA受體是一種谷氨酸離子型受體,在興奮性突觸可塑性中起著重要作用,特別是NR2B亞基,主要分布在脊髓背角,在誘導性疼痛的中樞敏化中起著重要作用[17]。NPP發生后,脊髓星形膠質細胞可通過多種途徑激活,它可以表達NMDA等神經遞質的受體,增加脊髓背角中神經遞質的釋放[18]。楊松等[19]研究發現造模成功后,星形膠質細胞表達較無損狀態高,其表達強度與周圍神經損傷密切相關。ZHAO等[20]研究電針對CCI大鼠的鎮痛機制,通過觀察脊髓背角NR2B的表達,發現CCI組的NR2B免疫反應細胞的數量明顯增加,通過抑制NR2B的表達,可以減輕疼痛。星形膠質細胞活化及其神經遞質的釋放會導致中樞敏化和突觸重塑以維持疼痛。本研究結果顯示,模型組脊髓背角星形膠質細胞活化明顯,GFAP和NR2B的表達增加;推拿組GFAP和NR2B表達顯著減少,說明推拿能抑制星型膠質細胞活化,降低GFAP和NR2B的表達,能達到治療NPP的作用。

3.5 結論

根據本次研究結果得出,推拿能改變CCI大鼠的行為學和形態學,主要表現為提高大鼠機械縮足閾值、降低疼痛強度,促進脊髓背角超微結構的修復和再生,改變突觸可塑性。推拿能抑制星形膠質細胞的活化,可顯著降低脊髓背角GFAP和NR2B的表達。結合行為學和形態學結果說明推拿可以通過機械刺激改變突觸的形態結構和可塑性來抑制突觸信號的傳遞和星形膠質細胞的活化,降低脊髓背角GFAP和NR2B的表達,最終抑制痛覺敏化,為研究推拿對CCI模型鼠的鎮痛作用提供行為學、形態學和分子生物學證據,闡明了推拿治療NPP的作用機理。推拿治療NPP作用顯著,它能改善NPP的痛覺過敏、自發性疼痛等癥狀,促進感覺功能和運功功能的恢復,本研究也為推拿治療NPP的療效提供了臨床依據;但未能統計突觸形態結構的具體參數,今后可進一步從Wnt/Ca2+通路出發,研究突觸可塑性、星形膠質細胞與推拿的鎮痛機理之間的關系,為推拿治療NPP提供科學依據和臨床指導。