雙夏秫米湯對大鼠睡眠改善作用的研究

王承灝 廖雪晶 孫資金 胡一帆 厲贏 吉靜 邵奇 王慶國 程發峰

失眠是一種表現為難以入睡或睡后易醒的臨床癥狀,其患者常常輾轉反側難以入眠且大多伴有多夢、頭昏、心悸、心煩、乏力、焦慮等表現。對于失眠的主流治療手段有藥物治療和認知行為療法兩種,但認知行為療法對醫師的專業資質及患者的依從性要求較高,并且療程較為長久,故一般以藥物治療為主。現代醫學仍沿用傳統的以苯二氮卓類為主的安眠藥,其在臨床中鎮靜催眠療效確切。常見藥物有艾司唑侖、阿普唑侖、地西泮、氯硝西泮、唑吡坦等。但苯二氮卓類藥物在人體內的半衰期各不相同,并且服用后表現出較多的副作用,有一定的成癮性,易被濫用。所以在臨床中治療失眠時苯二氮卓類藥物逐漸退居于二線選擇。

中醫藥相對于現代醫學在治療失眠癥方面有著歷史悠久,療效可靠且安全穩定的優勢和特點,許多著名的方藥如酸棗仁湯、天王補心丹、黃連阿膠湯等在當代依舊有著良好的臨床療效。北京中醫藥大學原副校長,第四屆國醫大師,中醫臨床基礎專業博士生導師王慶國教授在半夏湯的基礎上再加入夏枯草,擬名為雙夏秫米湯(半夏、夏枯草、薏苡仁)以治療多種證型的失眠,常能取得不俗療效[1-2]。本研究則以臨床常用劑量為參考,通過3個平行實驗探索雙夏秫米湯相較于地西泮對健康及失眠動物的藥效學、行為學等方面的影響及治療效果,從而為臨床使用及新藥研發供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

三個實驗均使用健康的雄性SD大鼠共132只(分別使用50只、70只、12只),體質量(180±20)g,SPF 級由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供,動物許可證號[SCXK(京)2019-0010]。所有動物在正式實驗之前以適應性飼養7天,期間室溫保持在(23±1)℃,以普通維持飼料喂養,自由飲水,墊料保持干燥,環境安靜。

1.2 實驗藥物

本實驗中所使用的清半夏、夏枯草、薏苡仁飲片均購于北京同仁堂股份有限公司。雙夏秫米湯制備方法如下:以1∶2∶1的比例取上三味藥物適量,置于圓底燒瓶中,加10倍量的去離子水回流提取兩次,每次1小時,濾過后合并提取液,減壓回收溶劑,置于水浴鍋上蒸干,直至浸膏無流動性后再真空干燥36小時,得浸膏,粉碎后避光干燥儲存。實驗前精密稱浸膏適量,加入生理鹽水后超聲處理10分鐘,分別配置成給藥量相當于臨床用量0.5、1、2(248.5、497、994 mg/kg)倍的混懸液,灌胃前加熱至適宜溫度。

1.3 主要儀器及實驗試劑

曠場實驗箱(北京眾實迪創科技發展有限公司)、8401-HS Data Conditioning and Acquisition System(Pinnacle Technology Inc.,美國)、ZNHW型智能恒溫電熱套(鄭州恒巖儀器有限公司)、KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、DZT-6050型真空干燥箱(上海齊欣科技儀器有限公司)、Sartorius BS 124S型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯有限公司)、HH-2數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)、RE-52A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);SHZ-Ⅱ水循環真空泵(河南省鞏義市英峪電子儀器廠)、牙科水泥(feiyubio公司)、大鼠立體定位儀、2 EEG/1 EMG Rat Headmount(美國PinnacleTechnology 公司)、帶線顱釘(美國PinnacleTechnology 公司)、電烙鐵(艾瑞澤)、睡眠腦電記錄系統(美國Pinnacle Technology 公司);

地西泮(北京益民藥業有限公司,批號:H11020898)、生理鹽水(石家莊四藥有限公司,批號:2007102107)、對氯苯丙氨酸(P-chlorophenylalanine,PCPA上海源葉生物科技有限公司,批號:C136727)、碳酸氫鈉(伊諾凱,批號:2011011277)、吐溫80(偶合,批號:W20060801)、盤尼西林(瑞沃德,批號:69-53-4)、戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司)。

1.4 雙夏秫米湯協同戊巴比妥鈉誘導動物睡眠實驗

1.4.1 實驗分組及方法[3-6]將50只大鼠為5組,每組10只,分別為空白組、陽性組、雙夏秫米湯低劑量組、雙夏秫米湯中劑量組、雙夏秫米湯高劑量組,各組的灌胃給藥體積為0.1 mL/10 g,實驗前禁食不禁水12小時。低、中、高劑量組分別以248.5 mg/kg、497 mg/kg、994 mg/kg的劑量給藥,空白組給同體積的生理鹽水,陽性組予0.9 mg/kg的地西泮。陽性組與其余各組小鼠分別于給藥1小時、30分鐘后腹腔注射閾上(35 mg/kg)劑量的戊巴比妥鈉溶液,將注射戊巴比妥鈉后15分鐘內停止移動的大鼠單獨放入另一個籠子。

1.4.2 觀察指標 鎮靜催眠作用:記錄各組大鼠的睡眠潛伏期與睡眠時長。大鼠注射戊巴比妥鈉后至其翻正反射消失1分鐘以上即判斷為入眠,這段持續時間為睡眠潛伏期。從入眠后至其翻正反射恢復(或恢復自主移動)這段持續時間為睡眠時長。

1.5 雙夏秫米湯對失眠模型大鼠的治療作用研究

1.5.1 失眠模型的建立[7-10]使用碳酸氫鈉將生理鹽水配置成弱堿性溶液,再加入適量的吐溫將PCPA配置成混懸液,80℃水浴加熱30分鐘后超聲處理10分鐘。將60只大鼠適應性飼養7天后,每日上午8:00腹腔注射400 mg/kg的PCPA,連續給藥2天,給藥體積0.1 mL/10 g。

1.5.2 失眠模型驗證 造模大鼠于末次注射PCPA的48小時內進行閾上劑量戊巴比妥鈉翻正實驗以進行模型驗證,操作同1.4。結果顯示:相較于未造模組,造模組大鼠的睡眠潛伏期顯著延長(P<0.001),且睡眠時長顯著縮短(P<0.01),由此證明失眠大鼠造模成功。結果見表1。

表1 失眠模型驗證分鐘)

1.5.3 實驗分組及治療[11-12]將60只大鼠為6組(10只健康大鼠與50只失眠大鼠),每組10只,分別為空白組、模型組、陽性組、雙夏秫米湯低劑量組、雙夏秫米湯中劑量組、雙夏秫米湯高劑量組,各組的灌胃給藥體積為0.1 mL/10 g。除空白組外,選用50只失眠模型復制成功的大鼠隨機分配為5組。每日上午9:00給藥,治療持續一周。低、中、高劑量組分別與以248.5 mg/kg、497 mg/kg、994 mg/kg劑量的自擬方浸膏,陽性組予0.9 mg/kg的地西泮,空白組和模型組給同體積的生理鹽水。

1.5.4 觀察指標 鎮靜催眠作用:記錄大鼠的睡眠潛伏期與睡眠時長。1.5.3中各組大鼠在治療結束前一天進行閾上劑量戊巴比妥鈉翻正實驗以驗證治療效果,操作同1.4。行為學影響:記錄大鼠的移動距離、穿格數、中央區停留時間、直立次數、修飾次數。1.5.3中各組大鼠于末次治療結束后的1～3小時內進行曠場實驗。實驗前先將大鼠置于曠場箱中適應1分鐘,隨后重新將大鼠放入曠場箱中5分鐘觀察并記錄以上指標。實驗期間保持環安靜,兩次實驗之間及時清理排泄物,并用75%的酒精噴灑場箱內壁及底面。大鼠一般情況:觀察并記錄各組大鼠造模后、治療后的體重,以及皮毛光澤、精神狀態、性情變化等表現。

1.6 雙夏秫米湯對大鼠睡眠結構的影響研究

1.6.1 腦電裝置(EEG Headmount)的植入 大鼠適應性飼養一周后以35 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉將大鼠麻醉,水平固定在立體定位儀上并脫去頭部的鼠毛。消毒后使用手術刀切開一個4 cm左右的切口并拭去多余的組織以暴露顱骨,確定前囟的位置。以前囟為中心,用顱鉆頭在四周鉆4個孔,各個孔的間隔不小于3 mm。用螺絲刀將帶線顱釘的2/3部分旋入孔中,顱釘末端應抵到硬腦膜。用牙科水泥將顱釘固定,待凝固后,使用電烙鐵將EEG Headmount的4個焊點分別與顱釘的4根導線焊接牢固,并剪去多余部分,再將Headmount的肌電圖(Electromyography,EMG)導線插入頸后肌,鋪設最后一層牙科水泥將暴露在外的線路覆蓋。水泥凝固后以碘酒消毒并將適量盤尼西林粉末均勻撒于傷口上,次日注射盤尼西林溶液以抗炎。手術后的大鼠獨籠飼養并恢復7天后進行實驗。

1.6.2 實驗分組及方法[13-18]采用平行對照的分組方法,將12只成功植入腦電裝置且恢復良好的大鼠分為陽性組與雙夏秫米湯組,每組6只,各組的灌胃給藥體積為0.1 mL/10 g。陽性組與夏枯草組分別予以0.9 mg/kg的地西泮和994 mg/kg的雙夏秫米湯混懸液。

實驗程序如圖1所示,每一只大鼠手術恢復7天后連接睡眠腦電記錄系統使其適應1天,適應期過后于實驗首日早9:00灌胃相應體積的生理鹽水,開始記錄腦電圖(Electroencephalogram,EEG)與EMG至晚17:00共8小時,做為空白組1和空白組2;實驗次日早9:00予以雙夏秫米湯或地西泮,開始記錄EEG與EMG至晚17:00共8小時,做為雙夏秫米湯組或陽性組。EEG、EMG記錄在安靜的暗室進行,期間不限制大鼠的食水,保證其在傳感器的牽引范圍內自由移動。

圖1 實驗流程圖

1.6.3 觀察指標 睡眠結構:記錄大鼠的睡眠潛伏期、睡眠時長、蘇醒時長、非快眼動睡眠(Non-Rapid Eye Movement Sleep,NREMS)時長及快眼動睡眠(Rapid Eye Movement Sleep,REMS)時長。通過使用EEG結合EMG的方法分析大鼠睡眠結構,將所采集到的的信號通過前置放大裝置放大100倍,高通濾波器設置為EEG:0.5 Hz、EMG:10 Hz;數據以10秒為一個單位被劃分為蘇醒,NREMS與REMS,使用分析軟件Sirenia Sleep進行睡眠結構自動分析。自動分析結束后,將由兩名實驗人員進行檢查校正,經二者校正后的數據相似度達到85%以上即采用。當大鼠的EMG信號幾乎無法被探測到時視為入睡(至少延續120秒),所消耗的時間視為睡眠潛伏期,NREMS與REMS的時長相加即為睡眠總時長。圖2中列舉了蘇醒、NREMS、REMS階段中的典型EMG、EEG、波形以及Delta、Theta的波頻圖。

圖2 典型蘇醒、NREMS、REMS的EEG、EMG Spectrum Plot圖例

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 雙夏秫米湯對大鼠的鎮靜催眠作用

閾上劑量戊巴比妥鈉翻正實驗結果顯示:與空白組相比,陽性組大鼠的睡眠潛伏期顯著縮短(P<0.001), 雙夏秫米湯各劑量組雖然呈現縮短的趨勢,但只有高劑量組有統計學意義(P<0.05);各組大鼠在睡眠時長方面也顯現出了的類似的趨勢,與空白組相比,陽性組的睡眠時長顯著延長(P<0.01),自擬方高劑量組延長顯著(P<0.05)。結果見表2。

表2 大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間比較分鐘)

通過EEG結合EMG觀察大鼠給藥后的睡眠潛伏期發現,與空白組2相比雙夏秫米湯組大鼠的睡眠潛伏期顯著縮短(P<0.01),與空白組1比較陽性組顯著縮短(P<0.001)。結果見表3。

表3 大鼠睡眠潛伏期比較分鐘)

2.2 雙夏秫米湯對失眠模型大鼠的治療作用

2.2.1 雙夏秫米湯對失眠大鼠睡眠的影響 第六次給藥后的閾上劑量戊巴比妥鈉翻正實驗結果顯示:與空白組相比,模型組大鼠的睡眠潛伏期顯著延長(P<0.001),睡眠時長顯著縮短(P<0.01)。與模型組相比,陽性、雙夏秫米湯中、高劑量組大鼠的睡眠潛伏期顯著縮短(P<0.001),陽性組大鼠的睡眠時長顯著延長(P<0.001),雙夏秫米湯高劑量組顯著延長(P<0.01)。結果見表4。

表4 失眠大鼠經治療后各組的睡眠潛伏期及睡眠時間比較分鐘)

2.2.2 雙夏秫米湯對失眠大鼠的行為學影響 末次給藥后的曠場實驗結果顯示:在移動距離方面,模型組大鼠與空白組相比總移動距離顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,陽性組大鼠的總移動距離顯著增長(P<0.01),雙夏秫米湯高劑量組增長顯著(P<0.001)。穿格數:與空白組相比,模型組大鼠的總穿格數顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,陽性組、雙夏秫米湯高劑量組大鼠的穿格數增長顯著(P<0.001)。中央區停留時間:與空白組相比,模型組大鼠的中央區停留時間顯著延長(P<0.001)。與模型組相比,陽性組、雙夏秫米湯中劑量組大鼠的中央區停留時間顯著縮短(P<0.01),雙夏秫米湯高劑量組顯著縮短(P<0.001)。直立次數:與空白組相比,模型組大鼠的直立次數顯著下降(P<0.001)。與模型組相比,陽性組、雙夏秫米湯高劑量組大鼠的直立次數顯著增加(P<0.05)。修飾次數:與空白組相比,模型組大鼠的修飾次數顯著增加(P<0.05)。與模型組相比,陽性組大鼠的修飾次數顯著下降(P<0.05),雙夏秫米湯中、高劑量組顯著下降(P<0.01)。結果見表5。

表5 失眠大鼠經治療后各組的曠場實驗結果比較

2.2.3 造模及給藥前后各組動物一般狀況 與未造模大鼠相比失眠模型大鼠造模后表現出明顯的攻擊性,晝夜躁擾不寧,皮毛光澤較差并且食量下降。經治療后,與模型組相比各給藥組大鼠的激惹性明顯降低,不再出現攻擊性行為;在體質量變化方面,經治療后與空白組相比模型組大鼠的體質量無明顯增長(P<0.001),與模型組相比,部分給藥組大鼠的體質量出現明顯的增長,其中陽性組增長顯著(P<0.01),雙夏秫米湯中、高劑量組增長顯著(P<0.05)。結果見表6。

表6 失眠大鼠不同給藥組治療前后的體質量增量比較

2.3 雙夏秫米湯對大鼠睡眠結構的影響

通過使用EEG結合EMG的方法分析大鼠睡眠結構,發現分別與空白組1和空白組2相比各給藥組大鼠的睡眠結構發生了很大程度的改變。見圖3。具體表現為雙夏秫米湯組蘇醒時長顯著縮短(P<0.001),睡眠、NREMS時長顯著延長(P<0.001),REMS時長顯著延長(P<0.05);陽性組大鼠的蘇醒時長顯著縮短(P<0.001),并且睡眠、NREMS、REMS時長都出現了延長的趨勢,其中睡眠以及NREMS時長顯著延長(P<0.001),但REMS時長的延長沒有統計學意義。結果見表7。

圖3 大鼠灌胃不同藥物后8小時內的睡眠時相圖

表7 大鼠給藥前后各個睡眠階段的時長分鐘)

3 討論

中醫稱失眠為不寐,《黃帝內經》提出了其根本原因在于營衛循行失常,即“陽不入陰”,認為若衛氣由于種種原因無法通過陽蹺而循行于陰經,致使其在陽過久滯留而人體出現“陽蹺盛、陰氣虛”的病理性局面,則會導致失眠[19]。對于失眠的治療,《靈樞》載有半夏湯一方,由半夏和秫米組成,原文言新病“覆杯則臥”久病“三飲而已”的神奇療效。歷代醫家使用半夏湯治療失眠的醫案屢見不鮮,但方中秫米究竟為何物卻觀點眾多。吳瑭認為秫米當為高粱,且因高粱常為藥肆不備故以薏苡仁代之,此法在當今臨床實踐中頗為實用,并且現代亦有重用薏苡仁治療失眠的臨床報道[20]。夏枯草雖然于我國現存最早的本草專著《神農本草經》中就有記載,但據筆者粗略考證,付梓于1825年的《重訂靈蘭要覽》最早記載了夏枯草治療失眠的功用,并且明確指出要伍以半夏才能發揮療效。自此以后,夏枯草加半夏作為治療失眠的備選藥對在近現代的臨床實踐中逐漸被認可,并的到了被施今墨、朱良春等大家的應用[21-22]。并且有部分學者以“半夏得至陰之氣而生而夏枯草得至陽之氣而長”為理論依據,認為二藥伍用可以針對“陽不入陰”的病機,通過平衡陰陽交通氣機以治療失眠[23-24]。 還有研究表明,夏枯草的醇提物具有明顯的鎮靜催眠作用,這與課題組前期研究的結果一致[25-26]。筆者團隊則認為半夏、夏枯草皆為治療失眠癥之要藥,并且薏苡仁味甘可以制約半夏的毒性,同時在方中可以起到顧護中焦以防夏枯草之苦寒敗胃的作用,故三藥合用,擬名“雙夏秫米湯”。在使用常規藥物治療失眠療效不理想時施之常收效顯著。

限于認知行為療法的種種限制,藥物治療依舊是現代醫學治療失眠癥的常用手段[27]。常用的藥物以苯二氮卓類為主,其在臨床中鎮靜催眠的臨療效確切。這類藥物的作用機制是依靠GABA-A 配體—門控氯離子通道復合體的苯二氮卓類受體相結合,從而加強氯離子通道的開放效率促進氯離子內流速率以強化GABA作用于睡眠中樞的能力[28]。但限于這類安眠藥的副作用及成癮性,臨床實踐中相應藥物的選擇應以患者失眠的具體癥狀表現及病情輕重來決定,因此針對中醫藥在治療失眠方面的優勢的基礎研究成為了其開發應用前必不可少的部分。

本項研究以觀察雙夏秫米湯的鎮靜催眠作用為起點,通過一系列平行實驗研究其對實驗動物睡眠的影響。首先以戊巴比妥鈉誘導睡眠這一經典方法,觀察不同劑量的雙夏秫米湯對健康及失眠大鼠的睡眠潛伏期及睡眠時長的影響。戊巴比妥鈉的作用機制是通過攔截存在于腦干網狀結構上行激活系統的多突觸傳遞,強化對中樞神經的抑制作用[29]。其實驗結果表明,高劑量的雙夏秫米湯可以有效的縮短健康大鼠的睡眠潛伏期,延長睡眠時長。該結論不僅肯定了雙夏秫米湯的鎮靜催眠作用,還為腦電實驗的給藥劑量奠定了基礎;對于失眠模型的復制則選用了腹腔注射PCPA的方法且成功通過了模型驗證。PCPA是5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)的合成酶抑制劑,有報道指出,大鼠注射PCPA后可明顯抑制腦內5-HT的合成,導致大鼠睡眠晝夜節律消失,從而近乎徹底失眠[30]。經過治療后,雙夏秫米湯中、高劑量組大鼠的體質量和一般狀態相較于模型組有了良好的改善,并且高劑量組大鼠的失眠狀況改善最明顯。此外雙夏秫米湯高劑量組大鼠在曠場實驗中的所有行為學指標均優于其他組。曠場實驗可以通過觀察包括直立和修飾的垂直運動則次數從一定程度上代表大鼠的空間認知能力和警覺性,通過觀察大鼠的移動距離和穿格數等水平運動指標從而反映水平活動探究能力及興奮程度,而中央格停留時間則可以體現大鼠的趨避性、焦慮或抑郁狀態以及認知能力[31-32]。而雙夏秫米湯高劑量組大鼠經治療后無論在戊巴比妥鈉誘導睡眠實驗還是曠場實驗中都表現出了與模型組截然相反的趨勢。因此可以推斷高劑量的雙夏秫米湯可以顯著改善PCPA失眠大鼠的失眠情況及激發其自主活動能力與探究水平,緩解緊張焦慮情緒,降低警覺性。

最后為了深入探究雙夏秫米湯對大鼠睡眠結構的影響,研究引入了采用了EEG協同EMG監測方法。腦電監測是對腦電波進行定量分析的方法,目前廣泛應用于睡眠、失眠、抑郁及癲癇等研究中。利用快速傅立葉變換完成對腦電波功率的分析,可以將腦電信號由時域轉換到相應的波頻區間[33-35]。其中,Delta波段的出現是NREMS的標志,而Theta波段則對應REMS,而在Wake出現的Alpha波段是一種與鎮靜催眠有關的高頻波,在逐漸進入NREMS階段時Delta波頻增強而Alpha波頻降低。具文獻報道,臨床常用的苯二氮卓類藥物主要作用就是縮短睡眠潛伏期并且延長睡眠時長,但同時會抑制腦電的活動,所以患者服用該類藥物會對晝間生活造成負面影響[36]。最典型的例子就是地西泮(又稱安定),文獻報道其可以延長 NREMS 時間,而對 REMS 起到抑制作用,但REMS是睡眠中至關重要的環節,REMS期間是人們在對一天生活中所獲得的信息進行加工整理使之條理化的過程,因此服用地西泮的副作用常表現為白天嗜睡,記憶力下降等降低晝間生活質量的癥狀,長期或過量服用還會導致部分生理功能障礙[37-38]。因此本研究的陽性藥全部選用地西泮,并且之前的實驗(1.4和1.5)證明了高劑量的雙夏秫米湯在鎮靜催眠與對失眠大鼠的睡眠及行為學改善方面的作用和地西泮相當,所以通過腦電觀測動物灌胃雙夏秫米湯后的睡眠結構變化是明確其相較于苯二氮卓類安眠藥優勢所在的關鍵環節。結果表明,大鼠在灌胃雙夏秫米湯和地西泮后的8小時內,其睡眠結構均發生了明顯的變化(見圖3)。不僅發現雙夏秫米湯縮短睡眠潛伏期的能力與地西泮不相上下(在以EMG信號為客觀標準的情況下),并且通過統計并分析比較蘇醒、睡眠、NREMS以及REMS階段的時長,發現雙夏秫米湯顯著地延長了NREMS和REMS時長,因此可以認為其優化了睡眠結構。而地西泮則僅僅延長NREMS時長,其REMS的變化無統計學意義,所以對整體睡眠結構的優化作用微乎其微。

鑒于由以上的實驗研究結果可以認為高劑量的雙夏秫米湯具有確切的鎮靜催眠作用,且對PCPA失眠模型大鼠的睡眠及行為能力起到了良好治療效果,并且相較于地西泮可以顯著地大鼠的改善睡眠結構。該方安全穩定,療效確切,并且實驗結論符合臨床實際,但其分子生物學層面的機制尚不明確,有待進一步研究。