當歸芍藥散及其拆方對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠血小板聚集率及內皮細胞粘附分子的影響

鹿藝星 孫月蒙 孫燕 宗毓麟 閆淑鑫 駢雪 高譽珊 李宇航

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病、高血壓、高脂血癥等心腦血管疾病的共同病理基礎,主要表現為血管內皮受損、細胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAMs)表達上調、諸多炎癥因子和脂質浸潤、巨噬細胞、平滑肌細胞等在血管內大量聚集、血管壁失去彈性、類黃色粥樣斑塊形成[1-3],多累及中、大動脈。全球每年死于AS相關疾病人數高達2000 萬,嚴重威脅著全人類的生命健康[4]。目前現代醫學治療AS藥物較多,主要以他汀類為代表,但長期使用導致肝腎損傷等諸多安全問題[5]。中醫藥在治療AS上具有作用緩和、療效持久、安全性高、副作用少等優勢[6]。因此,開展傳統中醫藥治療AS的實驗研究以及臨床試驗有潛在的發展前景。

當歸芍藥散是《金匱要略》經典方劑,具有活血散瘀、養血和血功效,符合AS痰濁內生、痰瘀互結于脈道的證候特點,廣泛應用于臨床且療效確切[7-8]。近年來醫學界越來越關注活血散瘀法治療AS的分子機制,多把血管粘附分子和血小板活化[9]作為血瘀證生成發展過程中重要的客觀依據。因此,本研究基于方證對應理論[10-11],從當歸芍藥散復方中拆分出單個方劑要素進行分析,以血小板聚集率和血管內皮細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)為切入點,研究當歸芍藥散及其拆方對ApoE-/-模型小鼠血小板聚集率和血管內皮粘附因子的影響,探討對AS的防治作用,以期為臨床提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通C57BL/6J 小鼠12 只;SPF級雄性C57BL/6J ApoE-/-小鼠72 只,6～8 周齡,體質量(20±2)g,均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。飼養于北京中醫藥大學良鄉校區動物房獨立通氣籠系統,室內溫度(25±2)℃,相對濕度40%～60%,12 小時明暗交替,自由進食與飲水。所有實驗方案得到北京中醫藥大學動物倫理委員會的批準(批號:BUCM-4-2021060802-2056)。

1.2 實驗藥物及制備

(1)當歸芍藥散[12]組成:當歸9 g、川芎24 g、白芍48 g、茯苓12 g、白術12 g、澤瀉24 g;(2)柔肝緩急組:白芍48 g;(3)健脾化濁組:茯苓12 g、白術12 g、澤瀉24 g;(4)活血散瘀組:當歸9 g、川芎24 g。中藥購自北京同仁堂京西藥店有限公司,并由北京中醫藥大學中醫學院中醫藥基礎理論與關鍵技術研究中心鑒定為正品。(蒸餾水浸泡中藥30 分鐘,武火煮沸后使用文火煎煮30 分鐘,提取藥液。再加入蒸餾水重復煎煮,去滓,將兩次提取的藥液混合,進行水浴蒸發濃縮,使用200目過濾網過濾制備中藥液,置于4℃冰箱中儲存以灌胃給藥。阿托伐他汀鈣片磨成粉末,使用蒸餾水制備成2 mg/mL懸浮液,置于4℃冰箱中保存備用。

阿托伐他汀鈣組:阿托伐他汀鈣片,由輝瑞制藥有限公司(美國,紐約)提供,批號:H20051408,規格:20 mg/片。

1.3 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛(OUBEI,OB10341-1);PBS緩沖液干粉(百瑞極,BN20220-L);粉劑型抗原修復液(邁新,MVS-0066);DAB顯色試劑盒(邁新,2109290031H);即用型免疫組化染色試劑盒(邁新,2108029706C);ICAM-1 Rabbit PolyAb兔多克隆抗體(proteintech,10020-1-AP);VCAM-1 Rabbit mAb兔多克隆抗體(Cell Signaling Technology,D2T4N);無水乙醇(國藥集團,10009218);二甲苯(國藥集團,10023418);氯化鈉溶液(OUBEI,OB20926);改良油紅O染色液(索萊寶, G1261)。

獨立通氣籠IVC飼養籠(江蘇,蘇杭科技器材有限公司);AL204電子天平(上海,梅特勒托利多儀器有限公司);正置顯微鏡(德國Leica,DM4B);YD-6L生物組織包埋機(金華市,益迪醫療設備有限公司);電熱恒溫培養箱(天津市,中環實驗電爐有限公司);電熱鼓風干燥箱(上海,恒科學儀器有限公司);普通體式顯微鏡(日本,SWZ745T);THZ-D臺式恒溫振蕩器(太倉市,實驗設備廠);血小板聚集儀(美國,CHRONO-LOG)。

1.4 分組及給藥

小鼠適應性喂養7 天后,將12 只普通C57BL/6J小鼠作為空白對照組,給予普通飲食飼養。72 只ApoE-/-小鼠給予高脂飲食(含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)隨機分為模型組、當歸芍藥散組、柔肝緩急組、健脾化濁組、活血散瘀組和阿托伐他汀鈣組,每組12 只。連續16 周,建立動脈粥樣硬化模型。

生藥劑量比例參照《方劑學》[12],根據“人與動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”折算[13],從實驗第一天開始給每組動物進行預防給藥,灌胃時間連續16 周,當歸芍藥散組、柔肝緩急組、健脾化濁組和活血散瘀組日給藥劑量分別為:16.77 g/kg、6.24 g/kg、6.24 g/kg、4.29 g/kg,阿托伐他汀鈣片組給藥劑量為5 mg/kg。小鼠給藥體積為0.2 mL/10 g,模型組和正常組給予等體積蒸餾水。

1.5 取材與檢測指標

1.5.1 樣本采集 在實驗第16 周結束,末次給藥后12 小時,禁食不禁水。記錄小鼠體質量等一般情況,腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉。采用眼球取血法收集約1～1.5 mL血液,各組隨機選取6 只小鼠眼球取血后將血液置于含0.1%肝素鈉的1.5 mL抗凝管中以檢測血小板聚集率,另外6 只小鼠眼球取血后將血液置于1.5 mL離心管中,用于血脂檢測;取血后在普通體式顯微鏡下開胸分離主動脈弓至髂動脈分叉處,清除外膜脂肪組織,用PBS緩沖液進行沖洗直至由紅色變成無色透明,完成整個主動脈剝離并進行拍照,置于4%多聚甲醛中固定備用。小鼠主動脈血管取材后,分別以每組6 只環切(血管垂直放入)、另外6 只縱切(血管水平放入)的方式,置于裝好OCT包埋劑的離心管內,并將主動脈血管在離心管內的位置用標記筆大致標出。

1.5.2 主動脈油紅O染色 取6 只環切的主動脈血管,按標記筆標記的位置進行修片,自出現血管組織開始,以10 μm厚度,每切三次取一張,連續留片,按照改良油紅O試劑盒說明書進行染色。使用正置顯微鏡拍攝血管切片染色,以觀察動脈粥樣硬化斑塊面積大小。用Image-Pro Plus 6.0軟件對AS斑塊進行標注和測量,計算斑塊面積與管腔面積比值,并評估AS模型是否成立以及各給藥組的干預效果。計算公式:斑塊面積占比=斑塊面積/管腔面積。

1.5.3 血小板聚集率檢測 將每組6 只小鼠血液置于含0.1%肝素鈉的1.5 mL抗凝管中,采用比濁法在血小板聚集儀上進行血小板聚集率的檢測。

1.5.4 活血散瘀療效評價 采用Image-Pro Plus 6.0軟件對小鼠縱切血管圖片進行分析,計算非斑塊面積與血管縱切總面積的比值,得出非斑塊面積率,然后除以血小板聚集率,給予活血散瘀療效評價。計算公式:活血散瘀療效評價=(縱切血管總面積-縱切斑塊面積)/縱切血管總面積/血小板聚集率。

1.5.5 血管內皮粘附因子水平 每組取另6 只縱切主動脈血管用于分子生物學檢測,按照試劑說明書步驟采用SP法檢測,ICAM-1、VCAM-1抗體分別用PBS按1∶280、1∶50比例稀釋,光鏡下觀測小鼠主動脈血管內皮粘附因子的表達。采用ImagePlus 6.0圖像分析軟件對免疫組化切片陽性表達區域的積分吸光度進行測定,計算平均吸光度(積分吸光度/主動脈橫截面積),以平均吸光度表示血管內皮粘附因子在主動脈中的表達強度。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況

實驗干預16 周后,正常組小鼠形體適中,反應靈敏,活動自如,毛色光亮,納食佳,大小便均正常;模型組小鼠形體偏胖,反應較遲鈍,毛色較正常組小鼠晦暗且有脫落現象,納食較多,大便稍硬,小便正常;當歸芍藥散組小鼠形體適中,反應靈敏,活動度較好,毛質光亮順滑,神態安詳,納食佳,大小便正常;柔肝緩急組小鼠較模型組小鼠偏瘦,反應稍靈敏,活動度良好,毛色較差,納食減少,大便稍軟,小便正常;健脾化濁組小鼠形體偏瘦,反應較為靈敏,活動度較好,毛質順滑有光澤,納食佳,大便軟,小便正常;活血散瘀組小鼠形體偏瘦,反應較靈活,活動度好,毛質順滑有光澤,納食如常,大便稍軟,小便正常;阿托伐他汀鈣組小鼠形體適中,反應敏捷,毛質光亮順滑,精神略躁,納食欠佳,大小便均正常。

2.2 各組小鼠主動脈油紅O染色結果

與正常組相比,模型組小鼠主動脈處斑塊堆積明顯增多,差異有統計學意義(P<0.05),證明AS造模成功;與模型組相比,各給藥組小鼠斑塊面積占比均不同程度減小,組間差異有統計學意義(P<0.05)。斑塊面積占比順序依次為:當歸芍藥散組<活血散瘀組<健脾化濁組<阿托伐他汀鈣組<柔肝緩急組。與當歸芍藥散組比較,其余給藥組斑塊面積顯著變大(P<0.05);與活血散瘀組比較,柔肝緩急組與阿托伐他汀鈣組斑塊面積顯著變大(P<0.05)。見圖1、表1。

注:A正常組;B 模型組;C 當歸芍藥散組;D 柔肝緩急組;E 健脾化濁組;F 活血散瘀組;G 阿托伐他汀鈣組。

表1 各組小鼠斑塊面積占比

2.3 各組小鼠血小板聚集率比較

與正常組比較,模型組血小板聚集率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,給藥組小鼠血小板聚集率均降低,其中當歸芍藥散組和活血散瘀組血小板聚集率顯著降低,組間差異有統計學意義(P<0.05)。各拆方組中,活血散瘀組降低血小板聚集率作用好,健脾化濁組次之,柔肝緩急組再次之,且與活血散瘀組比較,兩拆方組均有統計學差異(P<0.05)。與當歸芍藥散組比較,柔肝緩急組、健脾化濁組與阿托伐他汀鈣組血小板聚集率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血小板聚集率檢測

表3 各組小鼠活血散瘀療效評價

2.4 各組小鼠活血散瘀療效評價

與正常組比較,模型組活血散瘀療效評價低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,各給藥組小鼠療效評價均升高,順序依次為:柔肝緩急組<健脾化濁組<阿托伐他汀鈣組<活血散瘀組<當歸芍藥散組。其中當歸芍藥散組和活血散瘀組縱切非斑塊面積占比高,血小板聚集率數值小,活血散瘀療效評價好。與當歸芍藥散組比較,柔肝緩急組、健脾化濁組與阿托伐他汀鈣組療效評價水平顯著降低(P<0.05);與活血化瘀組比較,兩拆方組與阿托伐他汀鈣組療效評價顯著下降(P<0.05)。見表 3。

2.5 各組小鼠免疫組化染色結果

ICAM-1和VCAM-1在血管內皮集中表達,其陽性免疫反應產物呈棕黃色細顆粒狀。與正常組比較,模型組ICAM-1和VCAM-1在主動脈內皮表達顯著增多,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,各給藥組ICAM-1和VCAM-1表達均減少,組間差異有統計學意義(P<0.05)。其中當歸芍藥散組干預ICAM-1和VCAM-1效果最好,活血散瘀組次之。與當歸芍藥散組比較,柔肝緩急組、健脾化濁組ICAM-1表達顯著升高(P<0.05)。與活血化瘀組比較,柔肝緩急組、健脾化濁組ICAM-1表達顯著升高(P<0.05)。見表4、圖2、圖3。

注:A正常組;B 模型組;C 當歸芍藥散組;D 柔肝緩急組;E 健脾化濁組;F 活血散瘀組;G 阿托伐他汀鈣組。

注:A正常組;B 模型組;C 當歸芍藥散組;D 柔肝緩急組;E 健脾化濁組;F 活血散瘀組;G 阿托伐他汀鈣組。

表4 小鼠免疫組化粘附因子平均光密度值比較

3 討論

中醫學無動脈粥樣硬化的病名,根據臨床表現可歸屬為 “胸痹”“心痛”“脈積”等范疇。患者先天稟賦不足或后天失養,五臟受損,脾胃運化水谷津液功能障礙,產生痰濁、血瘀等病理產物,易結聚成塊阻滯脈道,血行不利,發為癥瘕。中醫認為瘀血貫穿AS發病始終[14],多采用活血散瘀法治療[15]。現代藥理學表明具有活血散瘀功效的中藥可以調節血流動力學、改善血管通透性、減少內皮細胞破損、通過對血小板和血管平滑肌細胞的影響,抑制血栓及減緩斑塊形成,改善AS臨床表現[16]。

近年來關于中醫證候的研究取得了極大進展,“證候要素”“方劑要素”和“方證要素對應”的相繼提出, 對于發展規范化、 科學化的中醫辨證論治體系具有重要價值[17-19]。以往研究當歸芍藥散拆方多從君臣佐使或者藥物功效(血藥、水藥)進行簡單劃分[20-23],多體現藥物配伍的主從關系或者是等級結構,臨床使用該方時須與本病機一致。然而患者病機往往是復雜的, 很難找到完全相符患者情況的方劑。而“方證要素對應”的組方原則是針對關鍵證候要素給與相對應的方劑要素,使組方藥物靶向更加明確,更加強調理法方藥的邏輯關系。臨證時抽取相對應的名方“組件”即可靈活使用,使得組方藥味多而不雜,少而義明。因此,本實驗運用“方證要素對應”的中醫組方原理對AS的證候要素進行分析,分別為:筋脈拘攣、脾虛痰濁內生、痰瘀互結,并與當歸芍藥散的方劑要素“柔肝緩急”“健脾化濁”“活血散瘀”一一對應。本實驗結果顯示,活血散瘀組較其他拆方組在減小斑塊面積、降低血小板聚集率和調節內皮細胞粘附分子方面效果好,其方劑要素由當歸和川芎組成,當歸味甘性辛,甘能補血,辛能行能散,辛散之力推動氣血周流以養血活血,為血中圣藥;川芎辛溫走竄,為血中氣藥,能活血行氣、調氣散瘀。二者潤燥相宜,相須為用,養血不致滋膩,祛瘀生新而不傷氣血。在臨床上常配伍使用發揮養血和血、活血化瘀的功效。

AS是一種慢性血管性炎癥反應疾病,血管內皮細胞結構和功能的變化是AS發生發展的始動環節。ICAM-1和VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族類,可以增強單核細胞的粘附和轉移能力,促進單核細胞向巨噬細胞、泡沫細胞的轉化[24]。同時體內表達過多的血管內皮粘附因子也是形成血栓的重要原因[25-26]。研究發現冠心病血瘀證患者血清中ICAM-1、VCAM-1存在高水平表達是衡量瘀血的有效敏感指標[27-28]。本實驗結果表明,當歸芍藥散組與活血散瘀組可有效抑制或下調ApoE-/-小鼠主動脈內皮ICAM-1和VCAM-1表達,從而減輕AS。此外,血小板大量聚集可促進AS脂質斑塊的形成和發展。其機理是單核細胞吞噬由血小板產生的富含脂質的顆粒,最終發展成含較多泡沫細胞的脂質斑塊[29]。本研究表明當歸芍藥散及其拆方均能降低血小板聚集率,以活血散瘀方劑要素效果最佳,表明該方劑要素在調節ApoE-/-動脈粥樣硬化模型小鼠血小板聚集率水平、抑制脂質斑塊形成起至關重要的作用。

本研究以血小板聚集率和血管內皮粘附分子作為切入點,結合斑塊面積及活血散瘀療效評價,評判當歸芍藥散及其方劑要素對AS的防治作用,為臨床使用當歸芍藥散及其方劑要素提供重要實驗依據。這對于指導臨床中醫用藥有一定的參考價值,其中活血散瘀組(當歸-川芎)是如何有效減小斑塊面積的信號通路尚不清楚以及當歸芍藥散中方劑要素的兩兩組合對AS斑塊面積是協同還是抑制作用,這些問題仍值得進一步的研究探索。