巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換對(duì)系統(tǒng)性硬化癥胞葬功能的調(diào)控機(jī)制研究*

杜萌萌，康冰心，李松偉

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）是一種以局部或廣泛性皮膚增厚和纖維化為征象的自身免疫性疾病[1]。本病起病隱匿，患病早期因癥狀不明顯常常被忽視，晚期容易累及多器官系統(tǒng)及組織（如皮膚、心、肺、腎、消化道等），并發(fā)多系統(tǒng)的纖維化，預(yù)后較差，致死率高，已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)的臨床難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)，因此闡明其發(fā)生機(jī)制及調(diào)控因素具有重要的臨床意義[2-3]。

胞葬作用是系統(tǒng)性硬化癥出現(xiàn)自身免疫逃逸、炎癥和纖維化的主要誘導(dǎo)因素[4]。巨噬細(xì)胞極化可以影響細(xì)胞表面受體的表達(dá)，引起巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，而巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換是調(diào)控胞葬作用的關(guān)鍵機(jī)制[5-6]。闡明系統(tǒng)性硬化癥疾病進(jìn)程中巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換對(duì)胞葬功能的調(diào)控機(jī)制，是防治該種疾病的關(guān)鍵。本研究采用HE 染色、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、流式細(xì)胞術(shù)等檢測方法，觀察系統(tǒng)性硬化癥疾病進(jìn)程中巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、胞葬功能和炎性纖維化因子的協(xié)同關(guān)系，探究巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換調(diào)控胞葬功能對(duì)系統(tǒng)性硬化癥疾病進(jìn)展的影響，闡明系統(tǒng)性硬化癥疾病進(jìn)展的病理機(jī)制，為該疾病的臨床治療提供新的干預(yù)思路和有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)BALB/c 雌性小鼠80只，鼠齡6～8 周，體質(zhì)量20 g（斯貝福）。

1.2 藥物 注射用鹽酸博來霉素溶液：用移液槍吸取博來霉素原液（日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)；批號(hào)：740130）100 μL，于10 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中混勻，配制成1 000 μg/mL 濃度的博來霉素溶液，分裝后放置于-80 ℃保存。

1.3 分組及造模 將80 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分為空白組和模型組，分籠普通飼料喂養(yǎng)，背部脫毛處理。脫毛區(qū)中央，空白對(duì)照組背部注射生理鹽水0.1 mL/（200 g·d），系統(tǒng)性硬化癥模型組背部注射博來霉素0.1 mL/（200 g·d）。

1.4 取樣及檢測指標(biāo) 每組分別于注藥后第7、14、21、28 d 取樣6 只，7%水合氯醛（360 mg/kg）腹腔注射麻醉，頸椎離斷處死。

HE 染色：取造模部位皮膚組織100 mg，10%多聚甲醛固定、二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片。蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，伊紅染色，自來水沖洗，脫水，透明，晾干，封片，于顯微鏡下觀察皮膚局部病理改變，測量真皮厚度。

熒光TUNEL：取造模部位皮膚組織100 mg，10%多聚甲酸固定、二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片。水化后，PBS 反復(fù)浸洗，加100 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片在37℃暗濕盒中反應(yīng)1 h，反應(yīng)終止后進(jìn)行酶標(biāo)、PBS 浸洗、DAB 顯色（避光），然后進(jìn)行蘇木素復(fù)染、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，綠色為凋亡細(xì)胞，用Image proplus 6.0 軟件處理分析，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

ELISA：抽取心包血1 mL，3 000 r/min 離心，取上清。將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行孔板加樣，37℃孵育90 min；吸板、加生物素標(biāo)記抗體、洗板、加過氧化物酶標(biāo)記的親和素（ABC）、洗板、加底物（TMB）和終止液，根據(jù)酶標(biāo)儀器操作方法，上機(jī)檢測OD 值（450 nm）處，血清胞葬橋連分子（GAS6 和MFG-E8）及血清炎癥因子（IL-17、IL-6、TNF-α、MMP-9 和TGF-β1）的表達(dá)水平。

RT-PCR：造模部位皮膚進(jìn)行液氮急凍，RT-PCR檢測模型組、空白對(duì)照組小鼠皮膚組織中巨噬細(xì)胞極化因子Arg-1、iNOS 的mRNA 水平。采用Trizol 試劑分別提取兩組小鼠皮膚組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入正向和反向引物以及SYBR 后，實(shí)時(shí)定量PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)q-PCR 引物設(shè)計(jì)相關(guān)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的目的基因和內(nèi)參基因的上游、下游基因（引物序列見表1），以β-actin 為內(nèi)參，用相對(duì)定量方法（2-△△Ct）計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

流式細(xì)胞術(shù)：注藥后第28 天每組分別取樣6 只，抽取心包血1 mL，流式細(xì)胞術(shù)檢測心包血全血細(xì)胞表面受體（清道夫受體SR-B1、SR-A1 和ITGβ5）的表達(dá)水平。

胞葬功能評(píng)價(jià)：注藥后第28 天每組分別取樣10只，提取空白組和模型組小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞和Jurkat 細(xì)胞（J），誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞（J）凋亡，分為空白M0 型巨噬細(xì)胞+Jurkat 細(xì)胞組（M0+J）、空白M0 型巨噬細(xì)胞+凋亡Jurkat 細(xì)胞組（M0+appJ）、M1 型巨噬細(xì)胞+Jurkat 細(xì)胞組（M1+J）、M1 型巨噬細(xì)胞+凋亡Jurkat 細(xì)胞組（M1+appJ），將巨噬細(xì)胞和Jurkat 細(xì)胞共培養(yǎng)90 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/m，離心5 min 取上清，流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估胞葬作用，用吞噬指數(shù)（phagocytosis index，PI）評(píng)估巨噬細(xì)胞對(duì)Jurkat 細(xì)胞的胞葬能力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析檢驗(yàn)多組間多時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)變化差異，采用單因素方差分析檢驗(yàn)多組間各指標(biāo)變化差異，組間及組內(nèi)兩兩比較均采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色、熒光TUNNEL 組間比較：模型組小鼠與對(duì)照組相比，皮膚真皮層厚度明顯增加，膠原纖維增生，炎癥細(xì)胞浸潤，巨噬細(xì)胞凋亡指數(shù)、凋亡細(xì)胞密度增加。組內(nèi)比較：空白組皮膚組織在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均未見明顯改變，組織結(jié)構(gòu)完整，真皮稍有增厚，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤及巨噬細(xì)胞凋亡改變。模型組出現(xiàn)真皮厚度、膠原纖維增生、炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，且巨噬細(xì)胞凋亡指數(shù)、凋亡細(xì)胞密度增加，呈時(shí)間依賴性，見圖1、圖2。

圖1 皮膚組織HE 及熒光TUNNEL 染色（×200）

圖2 熒光TUNEL 檢測皮膚組織巨噬細(xì)胞凋亡

2.2 ELISA 組間比較：模型組與空白組對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組內(nèi)比較：空白組血清中IL-17、IL-6、TNF-α、MMP-9、TGF-β1、GAS6 和MFG-E8 的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化；模型組血清中炎性纖維化因子表達(dá)升高、胞葬橋連分子表達(dá)下調(diào)，且均呈時(shí)間依賴性。見圖3。

圖3 ELISA 檢測血液上清細(xì)胞因子表達(dá)水平

2.3 RT-PCR 檢測 組間比較：與空白對(duì)照組比較，模型組皮膚組織中Arg-1 mRNA 的表達(dá)水平下調(diào)，而iNOS mRNA 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。組內(nèi)比較：空白組皮膚組織中iNOS、Arg-1 mRNA 的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化，模型組皮膚組織中iNOS mRNA 的表達(dá)上升，Arg-1 mRNA 的表達(dá)下調(diào)，具有時(shí)間依賴性。見圖4。

圖4 皮膚組織蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.4 流式細(xì)胞術(shù) 與空白對(duì)照組相比，SSc 模型組小鼠心包血分化巨噬細(xì)胞的PI 下降；空白組、模型組對(duì)凋亡Jurkat 細(xì)胞的胞葬能力均高于對(duì)Jurkat 細(xì)胞的胞葬能力；模型組巨噬細(xì)胞PI 較空白對(duì)照組降低，P＜0.05。與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞表面清道夫受體SR-B1、SR-A1 和ITGβ5 的表達(dá)下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 巨噬細(xì)胞清道夫受體、胞葬能力表達(dá)水平

3 討論

SSc 是自身免疫紊亂的一種病理反應(yīng)，以局部或廣泛性皮膚增厚與纖維化為征象，病變部位主要集中在皮膚、肺、腎等多組織器官。本研究中，SSc 模型組HE 染色顯示模型組小鼠背真皮厚度較對(duì)照組皮膚明顯增加（P<0.05），且模型組的皮脂腺、毛囊等皮膚附屬器明顯減少，脂肪層厚度變薄并被纖維組織包繞，符合SSc 病理表現(xiàn)。熒光TUNNEL 顯示模型組小鼠病變局部皮膚除了纖維化改變之外，伴隨巨噬細(xì)胞凋亡，巨噬細(xì)胞凋亡指數(shù)升高、凋亡細(xì)胞密度增加等病理表現(xiàn)。研究表明，在SSc 的病變過程中，機(jī)體炎性改變會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向促炎表型M1 型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡、皮膚纖維化改變。

SSc 發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，推測可能與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、免疫紊亂、環(huán)境等多種因素相關(guān)，自身免疫導(dǎo)致的炎癥和細(xì)胞因子失調(diào)是其最關(guān)鍵的病理機(jī)制[7]。最新研究表明，巨噬細(xì)胞是SSc 免疫功能的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，也是SSc 皮膚纖維化過程中最重要的調(diào)控因素，巨噬細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫下降，巨噬細(xì)胞極化誘導(dǎo)促炎和促纖維化介質(zhì)釋放，導(dǎo)致皮膚組織膠原堆積和纖維化[8-9]。此外，巨噬細(xì)胞的凋亡也會(huì)引起免疫微環(huán)境的紊亂，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞極化，巨噬細(xì)胞可以分化為促炎（M1 型）和抑炎（M2 型）兩種表型[10-11]。在發(fā)病早期，M1 型巨噬細(xì)胞招募炎性細(xì)胞以對(duì)抗病原體，發(fā)揮促炎效果，起主導(dǎo)作用；等病原消滅后，M2 型巨噬細(xì)胞抑制炎性細(xì)胞的募集，發(fā)揮抗炎效果，起主導(dǎo)作用[12]。持續(xù)不斷的M1 型活化會(huì)造成組織損傷，導(dǎo)致免疫、炎癥和纖維化改變。在本研究中，皮膚組織中M1 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物iNOS 的mRNA 表達(dá)上調(diào)、M2 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物Arg-1的mRNA 表達(dá)下調(diào)，表明在SSc 患者M(jìn)1 型巨噬細(xì)胞極化因子分泌增加，巨噬細(xì)胞向M1 型定向極化，進(jìn)而促進(jìn)了炎性、纖維化因子表達(dá)上調(diào)和免疫紊亂，導(dǎo)致SSc 病情進(jìn)展。M1 型促炎細(xì)胞會(huì)引起機(jī)體炎性改變，因此，在M1 型巨噬細(xì)胞極化過程中，血清IL-17、IL-6、TNF-α、MMP-9、TGF-β1 等炎癥、纖維化因子表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），表明在SSc 發(fā)病過程中，巨噬細(xì)胞以M1 型極化為主，M1 型極化與炎性改變呈正相關(guān)，引起纖維化改變，導(dǎo)致SSc 疾病的發(fā)生發(fā)展。

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬細(xì)胞將衰老、死亡的細(xì)胞吞噬、降解，防止繼發(fā)壞死、炎癥的過程，是維持正常生理學(xué)中組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病后恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素[13-14]。生理狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞通過胞葬作用有效清除凋亡細(xì)胞（apoptotic cell，AC）及其有害釋放因子，維持機(jī)體正常的免疫穩(wěn)態(tài)。在胞葬過程“eat me”階段，巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞表面清道夫受體與AC表面的橋連分子生長停滯特異性蛋6（recombinant growth arrest specific protein 6，GAS6）和乳脂球表皮生長因子8（milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8）結(jié)合，加速吞噬體組裝和酸化，從而促進(jìn)AC 降解，見圖6[15]。巨噬細(xì)胞表面受體（尤其是清道夫受體）及其橋連分子的表達(dá)水平是調(diào)節(jié)胞葬作用的關(guān)鍵分子。闡明系統(tǒng)性硬化癥疾病進(jìn)展過程中，清道夫受體及其橋連分子對(duì)巨噬細(xì)胞極化及胞葬功能的調(diào)控機(jī)制，是防治該種疾病的關(guān)鍵。在SSc 疾病進(jìn)展過程中，巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換可以影響細(xì)胞表面受體的表達(dá)，導(dǎo)致胞葬作用受損，進(jìn)而引起自體免疫性疾病和組織受損，成為導(dǎo)致系統(tǒng)性硬化癥出現(xiàn)自身免疫逃逸、炎癥和纖維化的關(guān)鍵機(jī)制[16]。巨噬細(xì)胞表面受體（尤其是清道夫受體）及其橋連分子在胞葬作用的過程中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，SSc 模型組清道夫受體（SR-B1、SR-A1 和ITGβ5）、胞葬橋連分子（GAS6 和MFG-E8）的表達(dá)均下調(diào)，PI 明顯下降，表明清道夫受體的受損影響了胞葬橋連分子的表達(dá)水平，引起PI 下降，損傷胞葬功能，進(jìn)而導(dǎo)致SSc 疾病的發(fā)生發(fā)展。且本研究數(shù)據(jù)表明，清道夫受體與M1 型極化因子表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，疾病早期，清道夫受體抑制及巨噬細(xì)胞M1 型定向極化共同導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡，損傷巨噬細(xì)胞胞葬功能，引起系統(tǒng)性硬化癥的炎癥反應(yīng)和皮膚纖維化進(jìn)展。

4 展望

盡管相關(guān)研究表明：在SSc 發(fā)病的早期階段，清道夫受體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1 型極化、抑制胞葬，導(dǎo)致疾病進(jìn)展；疾病后期巨噬細(xì)胞M2 型極化發(fā)揮抗炎效果，促進(jìn)SSc 病情恢復(fù)。但在SSc 后期，巨噬細(xì)胞胞葬在疾病回復(fù)過程中發(fā)揮了怎樣的作用，巨噬細(xì)胞M2型極化是否有助于增強(qiáng)胞葬功能、調(diào)節(jié)免疫，減輕SSc 的皮膚纖維化癥狀，有待進(jìn)一步探討。