UPLC-MS-MS法同時測定顛茄片中2個有效成分的含量*

董麗榮，李應才，孫 赟

（1.昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650031；2.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500）

顛茄片主要有效成分為阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿等托烷類生物堿[1-2]。由于含量高低相差懸殊，不適宜同時建立多成分的含量測定方法[3]。近年文獻報道，關于顛茄制劑的生物堿類有效成分的測定，均采用高效液相色譜法[4-5]。《中國藥典》2020 版一部對顛茄片中的硫酸天仙子胺、東莨菪內酯分別采用2 個不同的高效液相色譜法進行含量測定，方法分析時間長、效率低、操作繁瑣，其他峰對主峰干擾大。供試品取樣量樣量大（100 片），在實際監督抽檢工作中，往往樣品量難于滿足檢驗需求。本試驗建立了采用UPLC-MS/MS 法同時測定顛茄片中硫酸天仙子胺、東莨菪內酯2 種有效成分的定量分析方法。該方法靈敏準確，取樣量少，效率高，可為顛茄片質量標準的優化提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AB 4500 質譜儀（SCIEX）；LC-40 超高效液相色譜儀（島津公司）；AL204（萬分之一）電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；MS205DU（十萬分之一）電子天平（特勒-托利多儀器上海有限公司）；Arium comfortⅡ超純水儀（賽多利斯）；SK8210HP 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）。

1.2 對照品及試劑試藥 硫酸天仙子胺（批號110752-500912，純度96.0%），東莨菪內酯（批號110826-501616，純度99.6%），均來源于中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇（Fisher 公司），色譜純甲酸（國藥集團化學試劑有限公司）。3 批顛茄片均為天津力生制藥股份有限公司生產，批號分別為2101002、2111021、2110019。

2 方法與結果

2.1 色譜-質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液-甲醇，按照表1進行梯度洗脫；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量4.0 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 質譜條件 采用AB 4500 質譜系統，ESI 源，多反應監測（multiple reactions moniroring，MRM）模式，離子源溫度為550 ℃，正負離子掃描，得硫酸天仙子胺、東莨菪內酯的質譜參數見表2，與文獻[7]報道基本一致。

表2 各成分質譜參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取硫酸天仙子胺、東莨菪內酯兩種對照品各適量，分別置于10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，得硫酸天仙子胺、東莨菪內酯的質量濃度分別為0.212、0.180 mg·mL-1的單一照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，得硫酸天仙子胺、東莨菪內酯分別為0.998、1.001 μg·mL-1的混合照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液 分別取不同批次的顛茄片20片，精密稱定，研細，精密稱取約0.1 g 置于50 mL 量瓶中，加入50%甲醇溶液適量，超聲提?。l率33 kHz，功率250 W）15 min，放冷，用50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續濾液1.0 mL 至10 mL 量瓶中，用50%甲醇溶液定容，搖勻，經0.22 μm濾頭濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液適量，用50%甲醇稀釋成系列濃度混合對照品溶液，其中硫酸天仙子胺質量濃度分別為：193.6、387.2、580.8、774.4、968.0 ng·mL-1，東莨菪內酯質量濃度分別為：1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng·mL-1。取上述系列混合對照溶液，分別按“2.1”項下條件測定，線性回歸計算。結果見表3。結果表明，上述2 個成分在各自線性范圍內呈良好線性關系。

表3 回歸方程與線性范圍測定結果

2.3.2 檢測限與定量限測定 精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液，逐級稀釋后按“2.1”項條件測定，以離子對S/N 為3 考察其檢出限，結果硫酸天仙子胺和東莨菪內酯的檢出限分別為的0.25 pg·mL-1和0.10 pg·mL-1；以離子對S/N 為10 考察其定量限，結果硫酸天仙子胺和東莨菪內酯的定量限分別為0.87 pg·mL-1和0.49 pg·mL-1。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.3.1”項下項下的混合對照品溶液（硫酸天仙子胺、東莨菪內酯的質量濃度分別為387.19 ng·mL-1、200 ng·mL-1），按“2.1”項條件測定，連續進樣6 次，記錄各指標成分峰面積并計算其RSD 值。結果硫酸天仙子胺和東莨菪內酯峰面積的RSD 分別為0.91%和1.11%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取批號為2101002 的樣品，制備供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項條件測定，記錄各指標成分峰面積并計算其RSD值。結果硫酸天仙子胺和東莨菪內酯峰面積的RSD分別為1.25%和1.30%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批號樣品6 份，制備供試品溶液，按“2.1”項條件分別進樣測定，計算各指標成分的含量。結果硫酸天仙子胺、東莨菪內酯含量的RSD 分別為1.41%和0.97%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 準確度試驗 分別取已測含量的同一批號（批號為2101002）樣品6 份，每份取約0.1 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，分別精密加入硫酸天仙子胺和東莨菪內酯對照品溶液適量，按“2.2.2”項下的方法制備成供試品溶液。按“2.1”項下條件測定。結果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）

2.3.7 樣品含量測定 分別不同批號樣品，按“2.2.2”項下的方法制備成供試品溶液。按“2.1”項下條件分別進樣測定，計算含量。測定結果見表5。對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的MRM 色譜對比圖

表5 各成分含量測定結果（n=2）

3 討論與結論

3.1 色譜條件的優化 本實驗考察了有機相甲醇和乙腈及梯度洗脫對分離效果的影響。結果用乙腈作為流動相時，硫酸天仙子胺色譜峰出現分叉現象。本實驗通過更換色譜柱、調整梯等，依舊無法消除硫酸天仙子胺色譜峰出現分叉現象。故采用甲醇作為流動相，能得到理想的色譜峰形和分離效果，且質譜信號響應較強。

3.2 質譜條件的優化 東莨菪內酯在負離子模式形成的離子比正離子模式形成的離子豐度比更強，碎片離子穩定。綜合考慮選擇正負離子模式。

3.3 提取溶劑的選擇 本文參考2020 版《中國藥典》標準，對提取溶劑甲醇和水的比例進行了比較，綜合考慮了提取率，基質效應干擾等指標，最終確定甲醇-水（50 ∶50）為提取溶劑。

3.4 供試品溶液雜質峰探討 圖1中顯示，供試品溶液中存在東莨菪內酯的雜峰，其離子對信息和東莨菪內酯一致。通過查閱文獻可能是屬于和東莨菪內酯的同類生物堿。該生物堿是否為活性成分，需要進行質量標準控制，應需進一步研究。

3.5 結論 《中國藥典》2020年版一部采用兩種HPLC 法測定該藥中2 種成分的含量，硫酸天仙子胺和東莨菪內酯含量差異大（硫酸天仙子胺為每片70～120 μg、東莨菪內酯含量為每片不得少于2.2 μg），難于同時進混標測定，方法分離時間為50 min，雜峰干擾明顯。UPLC-MS/MS 法定性定量具有靈敏度高、分析速度快、抗干擾強等優勢，能大大縮短實驗時間，提高效率。本實驗建立了UPLC-MS/MS 法同時測定顛茄片中2 種成分的含量。該方法簡便快速、靈敏高效、所需樣品量小，可為優化提升該制劑質量標準提供參考。