脊髓脫細胞基質材料搭載hMSCs及bFGF治療大鼠脊髓損傷效果

何文麗 施春英 殷佳 閻文靜 王海萍

［摘要］ 目的 觀察脊髓脫細胞基質（SCDM）材料搭載人臍帶間充質干細胞（hMSCs）及堿性成纖維生長因子（bFGF）對大鼠脊髓損傷（SCI）的修復效果。

方法 制備SCDM并檢測其特性及生物相容性；對hMSCs及bFGF進行體外細胞活性檢測。將實驗大鼠分為對照組、SCDM組、SCDM+hMSCs組和SCDM+hMSCs+bFGF組，4組大鼠均行脊髓完全橫斷損傷，后3組SCI后給予相應治療。術后評價大鼠運動功能，4周后取出脊髓進行蘇木精-伊紅（HE）染色及相關免疫熒光染色。

結果 SCDM+hMSCs+bFGF組大鼠術后運動功能評分顯著高于對照組及SCDM組。HE染色結果顯示，4組大鼠脊髓組織均有炎癥細胞浸潤，其中對照組大鼠炎癥細胞浸潤最明顯。SCDM+hMSCs+bFGF組損傷中心Tuj1、Nestin免疫熒光染色強度高于其余各組，而GFAP免疫熒光強度低于對照組及SCDM組。

結論 該復合生物支架材料具有促進大鼠SCI修復的作用。

［關鍵詞］ 脊髓損傷；生物相容性材料；組織支架；臍帶；間充質干細胞；成纖維細胞生長因子2

［中圖分類號］ R318.1;R651.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0027-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.047

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230308.1401.020.html;2023-03-10 09：10：30

EFFECT OF SPINAL CORD DECELLULARIZED MATRIX CARRYING HUMAN UMBILICAL CORD MESENCHYMAL STEM CELLS AND BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR IN TREATMENT OF RATS WITH SPINAL CORD INJURY

HE Wenli， SHI Chunying， YIN Jia， YAN Wenjing， WANG Haiping

（Department of Neurology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］ ?Objective ?To investigate the effect of spinal cord decellularized matrix （SCDM） carrying human mesenchymal stem cells （hMSCs） and basic fibroblast growth factor （bFGF） on the repair of spinal cord injury （SCI） in rats.

Methods

SCDM was prepared and then tested in terms of characteristics and biocompatibility， and in vitro cell survival assay was performed for hMSCs and bFGF. Experimental rats were divided into control group， SCDM group， SCDM+hMSCs group， and SCDM+hMSCs+bFGF group; the rats in all four groups had complete spinal cord transection injury， and those in the latter three groups were given corresponding treatment after SCI. Motor function was evaluated after surgery， and the spinal cord was collected after four weeks for HE staining and immunofluorescent staining.

Results ?The SCDM+hMSCs+bFGF group had a significantly higher motor function score than the control group and the SCDM group. HE staining showed inflammatory cell infiltration in all four groups， with the most significant inflammatory cell infiltration in the control group. The SCDM+hMSCs+bFGF group had a significantly higher immunofluorescence intensity of Tuj1 and Nestin in the center of injury than the other three groups， as well as a significantly lower immunofluorescence intensity of GFAP than the control group and the SCDM group.

Conclusion ?This composite biological scaffold material can promote the repair of SCI in rats.

［KEY WORDS］ ?spinal cord injuries; biocompatible materials; tissue scaffolds; umbilical cord; mesenchymal stem cells; fibroblast growth factor 2

目前脊髓損傷（SCI）仍是病人致殘致死的重要因素，全球每年每百萬居民中有10.4～83.0人患SCI，臨床尚無有效治愈措施［1］。近年來，有多種神經組織工程生物材料被用于損傷脊髓組織的修復，如膠原蛋白水凝膠、殼聚糖水凝膠等，這些生物材料作為支架移植為神經元軸突再生提供了重要的物質基礎［2-4］。在脊髓組織修復過程中，治療的關鍵是構建合適的生態微環境，鼓勵內源性或外源性干細胞增殖、分化并促進脊髓神經組織再生［5-6］。脊髓脫細胞基質（SCDM）具有高度組織特異性，除了能夠模擬生物體生態微環境外，還可以提供一些細胞外基質蛋白如tenascin C（TNC）和堿性成纖維生長因子（bFGF），而這是天然生物材料及合成類生物材料所不具備的特性［7-8］。此外，有研究結果表明，來自中樞神經系統的脫細胞基質水凝膠可促進神經干細胞/祖細胞向神經元分化［9-10］。人臍帶間充質干細胞（hMSCs）因具有較高的分化潛能、較低的免疫原性而被應用于多種組織修復工程。hMSCs作為種子細胞移植入大鼠體內，除了能誘導部分干細胞增殖分化外，還可以作為神經再生的支持底物，建立細胞間信息傳遞，促進細胞的存活［11］。bFGF可以誘導內源性神經干細胞遷移、增殖、分化，同時具有保護神經的作用［12］。因此，本研究采用SCDM生物材料作為支架，搭載hMSCs及bFGF后移植入脊髓完全橫斷的大鼠體內，觀察該復合生物支架材料促進神經元分化、軸突再生及神經組織重建的效果，以期為臨床治療SCI提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 SCDM的制備及特性檢測

新鮮的豬脊髓反復沖洗后，去除表面硬脊膜、血管膜等組織，用眼科剪剪成約2 cm長的小段。經10 g/L的十二烷基硫酸鈉（SDS）及體積分數0.01的Triton溶液反復作用，脫去脊髓中的各類細胞，得到脊髓脫細胞組織。將組織置入凍干機中真空冷凍48 h，得到SCDM。對SCDM進行包埋并切片，在電鏡下觀察其表面特征，然后進行蘇木精-伊紅（HE）染色及Ⅰ型膠原蛋白免疫組織化學染色，于光鏡下觀察并拍照。此外，將SCDM研磨成粉，在室溫下用胃蛋白酶消化后離心，在4 ℃下取上清液與0.1 mol/L NaOH混合，置于37 ℃溫箱中凝膠化，得到SCDM水凝膠，用于體外細胞活性檢測。

1.2 體外細胞培養及細胞活性檢測

為檢測SCDM作為生物支架的生物相容性，將hMSCs分別接種在SCDM（3D組）及不含SCDM材料（對照組）中，置于細胞培養箱培養5 d后進行鈣黃綠素染色，觀察細胞在材料上的生長情況。為觀察bFGF濃度及SCDM對hMSCs細胞增殖的影響，將48孔板分為對照組（不含SCDM水凝膠）及SCDM組（加入100 μL SCDM水凝膠），將狀態良好的hMSCs加入48孔板中（培養液為含體積分數0.01胎牛血清的DMEM培養液），同時加入不同濃度梯度的bFGF（0、312.5、625.0、1 250.0 nmol/L），置于細胞培養箱中培養4 d后，取出48孔板，去除細胞培養液，每孔加入20 μL噻唑藍（MTT），置于37 ℃培養4 h，吸出MTT，加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫搖床（100 r/min）孵育10 min，每孔吸取50 μL置于96孔板中，在波長492 nm下測量吸光度值。

1.3 動物分組及處理

SD大鼠（體質量230～250 g）購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。本研究實驗程序均按照動物使用和護理指南進行，并經青島大學相關管理部門批準。實驗共使用32只SD大鼠，隨機分為對照組（SCI后未經任何治療）、SCDM組（SCI后給予SCDM支架移植治療）、SCDM+hMSCs組（SCI后給予SCDM支架+hMSCs移植治療）和SCDM+hMSCs+bFGF組（大鼠SCI后給予SCDM支架+hMSCs+bFGF移植治療），每組8只。SCI模型制備：大鼠麻醉后，在T9～T13椎體水平進行皮膚切口，移除T10和T11椎板，露出脊髓，使用顯微剪剪去一段3 mm長的脊髓。SCDM+hMSCs+bFGF組生物支架制作方法：將培養至第5代細胞密度為80%～90%的hMSCs用TrypLETM Express酶消化后置于EP管中；將100 ng bFGF溶于100 μL無菌PBS中（濃度為1 mg/L），取10 μL含有bFGF的PBS溶液，加入到含有hMSCs的EP管中，用移液槍混勻；將SCDM生物材料浸泡在此溶液中，待hMSCs及bFGF充分浸潤生物材料后，生物支架制備完成。SCDM組則將SCDM材料浸泡在10 μL不含有bFGF及hMSCs的PBS溶液中，SCDM+hMSCs組則將SCDM材料浸潤在含有hMSCs的10 μL PBS溶液中，制備生物支架。將制備好的生物支架移植入大鼠脊髓橫斷3 mm后的SCI部位（出血已控制），用6-0可吸收縫合線密實縫合大鼠脊椎椎旁肌肉，觀察無液體滲漏、無出血后，用6-0可吸收縫合線縫合大鼠背部筋膜層，觀察無滲液和出血后，用4-0不可吸收縫合線縫合大鼠背部皮膚，并用碘附消毒。

1.4 開放場地運動行為學評估

在SCI后4周內，采用Basso、Beattie和Bresna-

han試驗（BBB）評估大鼠后肢運動功能，在術后第0、1、2、3和4周采用雙盲法對大鼠進行運動功能評分并記錄數據。

1.5 組織學檢測

于SCI后第4周處死大鼠，取出脊髓組織，置40 g/L多聚甲醛中固定48 h，蔗糖脫水，OCT包埋，制備冷凍切片（7 μm）。分別進行HE染色及免疫熒光染色。所用一抗包括兔抗Tuj1（1∶500，美國Abcam）、兔抗GFAP（1∶300，美國CST）和鼠抗Nestin（1∶300，美國CST）。染色完成后在奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察，使用AJ-VERT圖像查看器捕獲圖像，應用ImageJ 1.53c軟件對免疫熒光強度進行量化分析。

1.6 統計學分析

使用GraphPad Prism 5及SPSS 23軟件進行統計學處理。各組細胞活性檢測吸光度值的比較采用析因設計方差分析，各組運動行為學評分的比較采用多組重復測量設計方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法；各組Tuj1、Nestin、GFAP免疫熒光強度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法。P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結? 果

2.1 SCDM的特性

HE染色顯示，SCDM材料中不含有細胞成分。Ⅰ型膠原免疫組織化學染色顯示，SCDM中含有豐富的Ⅰ型膠原蛋白，可以為細胞提供良好的黏附位點。電鏡觀察顯示，SCDM具有多孔結構，可為細胞提供棲息環境。見圖1。

2.2 SCDM的生物相容性

對照組及3D組細胞培養5 d后，進行鈣黃綠素染色，通過熒光顯微鏡觀察發現，對照組hMSCs多呈梭形生長，胞體較大，部分細胞為球形；而3D組hMSCs胞體較小，細胞形態為梭形并黏附于SCDM材料上生長。MTT結果顯示，隨bFGF濃度升高，細胞增殖數量增多，于625.0 nmol/L濃度時達到峰值，隨后細胞數量不再增加。析因設計方差分析表明，bFGF濃度和SCDM對hMSCs數量影響不存在交互作用（FSCDM=20.697，P＜0.05；FbFGF濃度=2.165，P＞0.05；FbFGF濃度*SCDM=1.117，P＞0.05）。單獨效應分析結果顯示，在bFGF濃度為312.5、625.0及1 250.0 nmol/L條件下，3D組細胞數量顯著多于對照組（P＜0.05），表明SCDM是影響細胞數量的獨立因素。見圖2A～E。

2.3 運動功能評分

SCI術后第0、1、2、3、4周分別對大鼠進行運動功能評分。多組重復測量設計方差分析表明，大鼠術后治療方式與時間之間具有交互作用（F組別=94.943，F時間=1 614.985，F組別*時間=49.162，P＜0.05）。兩兩比較顯示，SCDM+hMSCs+bFGF組

大鼠在第2、3、4周的運動功能評分均明顯高于對照組和SCDM組，差異具有顯著意義（P＜0.05）。見圖2F。

2.4 HE染色

本文4組脊髓組織均有炎癥細胞浸潤，其中對照組炎癥細胞浸潤最明顯。與對照組和SCDM組相比，SCDM+hMSCs+bFGF組大鼠脊髓移植部位周圍的線性纖維組織密度和細胞浸潤顯著增加。見圖3。

2.5 SCDM材料搭載hMSCs及bFGF治療對SCI大鼠神經軸突再生的影響

Tuj1用于軸突免疫熒光染色。術后第4周，各組脊髓組織分界面均可見Tuj1陽性細胞，其中對照組損傷部位僅出現少量Tuj1陽性細胞。4組Tuj1免疫熒光強度比較差異有顯著意義（F=40.450，P＜0.05）。兩兩比較結果顯示，SCDM+hMSCs+bFGF組損傷部位的Tuj1免疫熒光強度均高于其他各組，差異有顯著意義（P＜0.05）。見圖4。

Nestin抗體用于檢測SCI后神經干細胞的存在。術后第4周，SCDM+hMSCs+bFGF組脊髓組織損傷部位存在較多的Nestin陽性細胞。4組Nestin免疫熒光強度比較差異有統計學意義（F=31.970，P＜0.05）。兩兩比較結果顯示，SCDM+hMSCs+bFGF組損傷部位的Nestin免疫熒光強度顯著高于其他各組，差異有顯著意義（P＜0.05）。見圖5。

GFAP免疫熒光染色用于檢測SCI區的陽性星形膠質細胞。術后第4周，各組脊髓組織SCI部位均有GFAP陽性細胞。4組GFAP免疫熒光強度比較差異有統計學意義（F=27.000，P＜0.05）。兩兩比較結果顯示，SCDM+hMSCs+bFGF組損傷部位的GFAP免疫熒光強度低于對照組和SCDM組，差異有顯著意義（P＜0.05）。見圖6。

3 討? 論

軸突再生在SCI的治療中起著關鍵作用，神經細胞的丟失和繼發性損傷使嚴重SCI病人難以康復［13］。研究表明，促進神經元再生和軸突延伸是修復SCI的主要方式。生物材料一直是神經再生和組織工程領域的研究熱點，它不僅可以為軸突延伸提供物理支持，還可以為各種細胞和藥物提供輸送系統。大量的天然和合成高分子生物材料已被用作組織工程的支架材料，如膠原蛋白、殼聚糖、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）及聚乙二醇（PEG）等［14］。然而，天然生物材料難以模擬細胞外基質成分和復雜的生態微環境；對于合成類材料而言，它們具有降解能力，可以用作植入物，但PLGA等合成類材料的降解會導致周圍環境呈酸性，可能增強炎癥反應［15］。

與天然材料和合成類材料相比，SCDM模擬了實際的脊髓基質生態微環境，具有更高的孔隙率，從而增強了神經干/祖細胞的遷移、增殖能力。而且，SCDM具有特定的細胞外基質蛋白，例如TNC和bFGF，它們參與調節神經干/祖細胞的分化［8］。此外，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色證實SCDM含有Ⅰ型膠原成分。SCDM的以上特性促進了hMSCs黏附，模擬了細胞存活的生態微環境［16］。本研究在SCDM材料上體外培養hMSCs，結果顯示，SCDM具有良好的生物相容性，并可為細胞提供適宜的黏附位點。細胞活性檢測結果提示，bFGF在一定濃度梯度范圍內具有促進hMSCs細胞增殖的作用。動物實驗結果顯示，用從豬脊髓中提取的SCDM生物材料搭載hMSCs及bFGF治療脊髓完全橫斷的大鼠，術后第4周，SCDM+hMSCs+bFGF組TuJ1陽性細胞及Nestin陽性神經干細胞數量明顯高于其他各組，而GFAP陽性膠質細胞數量明顯低于對照組和SCDM組。提示該生物材料填充了脊髓組織缺損區，誘導神經干細胞遷移進入損傷區域，促進了神經元增殖分化及神經軸突再生。

綜上所述，本研究構建了一種搭載hMSCs及bFGF的功能性SCDM支架，該功能性支架移植到SCI部位可為神經軸突再生提供良好的物質基礎，引導損傷部位軸突生長，促進功能恢復。本研究結果為臨床治療SCI病人提供了新思路。

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（本文編輯 馬偉平）