關節腔內注射滇白珠醇提取液治療急性痛風性關節炎的實驗研究*

姚文琴,覃云璐,黨榮敏,王 恒,鄧 瑩,王定瑜

黔南民族醫學高等?？茖W校,貴州都勻 558003

急性痛風性關節炎是由單鈉尿酸鹽沉積在關節囊、滑囊、軟骨、骨質和其他組織中所致的晶體相關性關節病。越來越多的證據表明,代謝-免疫-炎癥是一個相互影響的復雜“網絡”,“網絡”中各種分子間相互作用,導致疾病發生、發展[1]。目前痛風性關節炎的治療主要包括緩解發作時疼痛和抑制炎癥反應,常用藥物為非甾體消炎藥、秋水仙堿、糖皮質激素等,藥物不良反應大。杜鵑花科植物滇白珠的莖葉性熱、味辛辣,屬熱藥,入冷經,其根、梗具有活血化瘀、祛風除濕作用,可治療風寒濕痹、筋骨疼痛[2]。滇白珠的化學成分類型主要有黃酮類、萜類、水楊酸甲酯糖苷類、木脂素類、香豆精類、有機酸類和甾體類,還含有香豆素、生物堿等[3],具有鎮痛、抗炎、抗病毒作用。臨床常見含滇白珠的復方成藥有痛風靈、滇白珠糖漿、復方伸筋膠囊等,多用于急性痛風性關節炎、類風濕關節炎、跌打損傷和濕疹等方面的治療[4]。滇白珠是貴州苗族民間治療痛風的常用藥材,有研究報道采用灌胃治療效果突出[5-6]。本研究采用大鼠關節腔內注射滇白珠醇提取液的新治療手段,觀察其治療作用并分析作用機制,為臨床用藥、開發新藥、擴大新藥源提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級SD雄性大鼠50只,體質量250～270 g,購自貴州醫科大學實驗動物中心,合格證號:SCXK(黔) 2018-0001。滇白珠購自貴州省都勻市藥材市場,經黔南民族醫專藥學系鑒定為杜鵑花植物滇白珠。

1.2儀器與試劑 尿酸鈉結晶(Sigma公司,規格:5 g,批號:102306692);大鼠白細胞介素(IL)-17、血管內皮生長因子 (VEGF)、IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:201904);酶標儀(北京凱奧K6600A)。

1.3方法

1.3.1滇白珠醇提取液的提取 藥物提取采用醇提法,提取方法如下:稱取滇白珠粗粉74 g置于100 mL圓底燒瓶中加70%乙醇800 mL,水浴加熱1 h,減壓過濾,取濾渣置于原燒瓶內加70%乙醇700 mL,再次水浴加熱1 h后減壓過濾,合并兩次提取液,減壓濃縮到無醇味,分別取一定體積配制成濃度(相當于原藥材)為4、2、1 g/mL儲備液備用。

1.3.2動物分組 50只SD大鼠按隨機數字表法分為5組,每組10只,分別設空白對照組、模型組及滇白珠醇提取液治療高劑量組(4 g/kg)、中劑量組(2 g/kg)、低劑量組(1g/kg)。

1.3.3模型的建立與實驗干預 取 500 mg單鈉尿酸鹽晶體,加 2 mL 吐溫80,再加入無菌生理鹽水后用磁力攪拌器加熱攪拌,直至晶體完全溶解,定容至 20 mL,制成 25 mg/mL單鈉尿酸鹽晶體混懸液,高壓滅菌后,于4 ℃ 保存,用前搖勻。SD 大鼠適應性喂養1周,參照文獻[7]造模方法,水合氯醛麻醉后以大鼠右后肢背側正中踝關節與脛腓骨之間的關節腔為進針點,將踝關節擺放成直角,充分暴露踝關節與脛腓骨的間隙,注射針頭與脛骨成45°夾角插入關節腔,模型組及滇白珠醇提取液各劑量組均注射0.2 mL 25 mg/mL單鈉尿酸鹽晶體混懸液制備急性痛風性關節炎模型。造模成功后,滇白珠醇提取液高、中、低劑量組分別給予4、2、1 g/kg滇白珠醇提取液0.2 mL關節腔內注射,模型組以同樣方法僅注射 0.2 mL無菌生理鹽水,均連續給藥 1周。空白組不予任何處理。

1.3.4指標檢測 模型組造模第7 天,滇白珠醇提取液各劑量組末次給藥1 h 后,取各組大鼠股動脈血,靜置,2 000 r/min離心15 min,取上清液,在-20 ℃ 下保存待測。采用ELISA檢測血清 IL-17、VEGF、IL-6水平。

病理檢查:剪取踝關節置10%甲醛液中固定脫鈣,梯度乙醇脫水,將透明處理后的組織塊放入已溶化石蠟內浸蠟包埋、切片,干燥待染。將石蠟切片脫蠟、水洗后HE染色鏡檢。光學顯微鏡下觀察大鼠踝關節滑膜炎癥與程度及關節軟骨細胞等情況。炎癥細胞浸潤評分標準[8]:無炎癥,計0分;輕度炎癥,可見少量白細胞浸潤,計1分;中度炎癥,可見2個或以上的白細胞聚集物,計2分;重度炎癥,出現白細胞融合及浸潤顯著,計3分。

2 結 果

2.1各組大鼠血清IL-17、VEGF、IL-6水平比較 與模型組相比,滇白珠醇提取液不同劑量組血清中IL-17、VEGF、IL-6水平均明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05),滇白珠醇提取液中、高劑量組血清IL-17、VEGF、IL-6水平均低于滇白珠醇提取液低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05);滇白珠醇提取液高劑量組血清IL-17、VEGF水平與滇白珠醇提取液中劑量組相比,差異均無統計學意義(P>0.05)。滇白珠醇提取液高劑量組血清IL-6水平低于滇白珠醇提取液中劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-17、VEGF、IL-6水平比較

2.2急性痛風性關節炎大鼠踝關節病理檢查結果 病理檢查結果顯示:滇白珠醇提取液不同劑量組與模型組比較,局部血管內有較多中性粒細胞,上皮及皮下充血明顯。滇白珠醇提取液低劑量組纖維組織及滑膜輕度增生;滇白珠醇提取液中劑量組較多淋巴細胞、漿細胞浸潤,色素沉著,滑膜輕度增生;滇白珠醇提取液高劑量組肉芽組織增生,大量淋巴細胞、漿細胞浸潤,滑膜未見增生,關節軟骨及骨組織結構形態正常,未見痛風結節。見圖1。

注:A為空白對照組;B為模型組;C為滇白珠醇提取液低劑量組;D為滇白珠醇提取液中劑量組;E為滇白珠醇提取液高劑量組。圖1 踝關節組織病理檢查結果(HE染色,×200)

3 討 論

急性痛風性關節炎是臨床常見病,發作時嚴重影響患者的日常生活,如不積極治療極易致殘、致畸,影響關節功能。急性痛風性關節炎發病的免疫學機制涉及多條與炎癥相關的信號通路,即Toll樣因子受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)依賴性核因子-κB 信號通路、Nod 樣受體蛋白 3 炎性小體、脂聯素、三磷酸腺苷(ATP)-P2X7R 信號通路等,關節滑膜炎癥因子及其組成的滑膜免疫微環境在急性痛風性關節炎發病過程中占有重要地位,它們可通過多個信號通路介導痛風的發病[9]。

痛風性關節炎急性期多采用秋水仙堿、非甾體消炎藥進行抗炎止痛對癥治療,但存在胃腸反應及肝腎功能損害等不良反應。中醫認為“濁瘀”是痛風的發病病機,使用祛濕化濁或祛濕化瘀藥可緩解。我國天然物產資源豐富,作為安全、有效的天然抗急性痛風性關節炎制劑的藥用植物研發必將取得突破性進展,潛藏著巨大的開發價值。肖壯等[10]研究證實滇白珠具有抗炎鎮痛、抑菌、抗氧化及抑制炎癥介質產生與分泌的作用。天然藥物治療急性痛風性關節炎給藥方式多數為口服,關節腔內注射是目前臨床用于骨、關節疾病治療的常用方法,可用于緩解關節腫痛、損傷[11-12]。采用不同劑量滇白珠醇提取液關節腔注射治療急性痛風性關節炎,通過將藥物直接輸送到炎癥部位,改變藥物在體內的分布模式,避開了藥物在體內轉運過程中必經的生理屏障,以最小的劑量發揮最大的作用。

急性痛風性關節炎模型中單鈉尿酸鹽晶體沉積在關節、滑膜引起炎癥應激反應,核因子NF-κB信號傳導可調節大量活化的吞噬細胞、Th細胞亞群等炎癥細胞分泌細胞因子,產生炎癥級聯反應。有研究顯示血清 VEGF、IL-17、IL-6水平可以作為判斷急性痛風性關節炎病情嚴重程度的重要指標[13-14]。本實驗觀察關節腔內注射不同劑量滇白珠醇提取液對急性痛風性關節炎大鼠的治療作用及對血清IL-17、VEGF、IL-6水平的影響,結果顯示與模型組比較,滇白珠醇提取液不同劑量組血清中IL-17、VEGF、IL-6水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。滇白珠醇提取液中、高劑量組血清IL-17、VEGF水平均低于滇白珠醇提取液低劑量組(P<0.05),而滇白珠醇提取液高劑量組血清IL-17、VEGF水平與滇白珠醇提取液中劑量組相比,差異均無統計學意義(P>0.05)。滇白珠醇提取液低、中、高劑量組血清IL-6水平兩兩組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。分析其原因可能是因為滇白珠醇提取液關節腔內注射后,下調血液中VEGF水平,VEGF作為直接作用于血管內皮細胞的有絲分裂原,其促進新生血管的形成能力及血管的通透性顯著下降,血管內物質的滲出減少,同時Th17細胞分泌產生的IL-17減少,抑制炎癥介質的產生與分泌。IL-6 是一種多功能炎癥細胞因子,不僅可以直接參與炎癥反應,同時也可以促進其他炎癥因子的釋放,加強炎癥反應,在痛風性關節炎發病過程中扮演重要角色。IL-6水平降低后,導滑膜炎癥反應和軟骨破壞減輕,可能與在炎癥局部直接發揮抗炎作用有關,炎癥的形成和發展受到抑制。病理結果也證實,滇白珠醇提取液不同劑量組與模型組比較,局部血管內有較多中性粒細胞,上皮及皮下充血明顯;滇白珠醇提取液低劑量組纖維組織及滑膜輕度增生;滇白珠醇提取液中劑量組較多淋巴細胞、漿細胞浸潤,色素沉著,滑膜輕度增生;滇白珠醇提取液高劑量組肉芽組織增生,大量淋巴細胞、漿細胞浸潤,滑膜未見增生,關節軟骨及骨組織結構形態正常,未見痛風結節。

綜上所述,本實驗研究結果顯示關節腔內注射滇白珠醇提取液對急性痛風性關節炎有治療效果,呈現劑量依賴,可能與下調血清IL-17、VGEF、IL-6等炎癥因子水平有關,但確切的作用機制還有待進一步研究。