支氣管肺泡灌洗液宏基因組二代測序在非中性粒細胞減少肺曲霉感染中的診治價值

周群 費黎明 尤青海

當前,非中性粒細胞減少肺曲霉感染呈上升趨勢[1],且因其臨床表現無特異性,很難實現及時診治[2]。因此,認識該菌感染的特點和多樣性,評估易感群體,早期進行有效干預極為重要。迄今,確診肺曲霉感染的方法仍依賴于病理,但耗時較長[3]。傳統病原學方法費時且檢出率低。基于高通量測序的宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)因其快速循環和高敏感性被認為是有前景的微生物鑒別技術[4]。前期關于mNGS的研究多集中在發現病原體上[5]。有研究闡明,在診斷肺部真菌感染方面,mNGS較傳統檢測技術有更高的敏感性[6-7],但仍缺乏真菌感染的臨床經驗,尤其在曲霉感染方面。據此,該文針對真菌感染領域進行了回顧性研究,探索支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的mNGS在非中性粒細胞減少肺曲霉感染中的診斷效能及對臨床治療的指導價值。

資料與方法

一、臨床資料

收集2021年11月至2022年12月入住安徽醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科(含內科ICU病區)32例非中性粒細胞減少患者的臨床資料,其BALF的mNGS示真菌。兩位資深臨床醫師根據宿主因素、臨床特征、胸部CT、實驗室指標及治療反應評估是否為肺曲霉感染,最終17例被評估為肺曲霉感染,15例為非肺曲霉感染。以下為排除標準:(1)年齡<18歲;(2)中性粒細胞減少(中性粒細胞絕對計數<1.5×109/L);(3)未做BALF的mNGS;(4)病歷資料不完整。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究倫理委員會審查批準(批件號:PJ2023-02-42)。

二、研究方法

1 標本收集

BALF標本由安徽醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科專業的氣管鏡醫師采集。利多卡因局麻后,根據胸部CT選擇取樣位置,20mL生理鹽水灌入目標段支氣管,重復3次,利用負壓回收BALF入無菌痰液收集器。為避免污染,樣本的前20mL被舍棄,剩余標本送檢mNGS、傳統病原學(革蘭染色、抗酸染色、普通細菌培養+藥敏、真菌培養等)及半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)試驗。

2 mNGS檢測

收集的BALF標本委托予果生物科技有限公司進行mNGS檢測。具體程序包括提取樣本核酸、構建文庫、對樣本微生物進行核酸測序、分析比對數據、報告可疑致病微生物。

三、統計學分析

結 果

一、臨床資料特征

回顧性分析32例非中性粒細胞減少的患者,17例納入肺曲霉感染組,15例歸為非肺曲霉感染組。兩組的性別、年齡和基本臨床資料構成相似。臨床表現方面,肺曲霉感染組呼吸音異常16例(94.1%),咳嗽12例(70.6%),胸悶/呼吸困難12例(70.6%),但較非肺曲霉感染組比較差異無統計學意義。咯血/痰血多見于肺曲霉感染組,兩組比較有統計學差異(P<0.05)。肺曲霉感染組12例(70.6%)患者存在營養不良,居潛在疾病首位。肺曲霉感染組患者免疫低下情況較非肺曲霉感染組發生率高,且在全身應用皮質類固醇激素方面明顯高于非肺曲霉感染組(P<0.05)。肺曲霉感染組胸部CT表現上17例(100.0%)均為多發病變,14例(82.4%)表現為雙肺浸潤,13例(76.5%)可見斑片狀陰影。而曲霉感染較特異的新月征和暈征在兩組CT表現中均未顯現。兩組實驗室指標比較差異無統計學意義(見表1)。

二、 mNGS與傳統病原學方法陽性率的比較

32例非中性粒細胞減少患者中,mNGS檢出32例(100.0%),傳統病原學方法檢出16例(50.0%),mNGS的陽性率明顯高于傳統病原學方法(P<0.001)。無論肺曲霉感染組還是非肺曲霉感染組,mNGS的陽性率均較傳統病原學方法明顯增高(P<0.05)(見表2)。

聚焦肺曲霉感染組BALF的mNGS、培養和GM試驗,發現三組間有明顯差異(P<0.001)。mNGS組的陽性率均明顯高于培養組及GM試驗組(P均<0.001),而培養組和GM試驗組比較無明顯差異(P>0.05)(見表3)。

三、非中性粒細胞減少肺曲霉感染組病原體分布

混合感染在非中性粒細胞減少肺曲霉感染組較常見。(圖1)描述了肺曲霉感染組BALF的mNGS中共病原種類分布。該方法對共病原的鑒定效果令人滿意(94.1%),其中曲霉-細菌-其他真菌-病毒混合感染最多見(23.5%)。共病原中最常見的細菌是銅綠假單胞菌,真菌占首位的是白色念珠菌,最多見的病毒是人類皰疹病毒1型和人巨細胞病毒(圖2),提示應加強對肺曲霉感染患者混合感染的防治。

圖1 肺曲霉感染組BALF的mNGS中共病原種類分布(n=17)

圖2 肺曲霉感染組BALF的mNGS中共病原分布(n=17)

四、BALF的mNGS對非中性粒細胞減少肺曲霉感染抗菌治療的指導作用

(表4)顯示了17例非中性粒細胞減少肺曲霉感染患者的抗菌治療記錄。根據mNGS結果,88.2%的患者改變了抗菌治療方案,52.9%的患者調整了抗菌譜,76.5%的患者開始使用抗曲霉菌藥物。需注意11.8%的患者治療方案無變化,因其前期已經驗性抗曲霉治療。這其中跟蹤了2例非中性粒細胞減少肺曲霉感染患者抗曲霉治療前后mNGS中曲霉序列數的動態改變。1例抗曲霉治療1周及2周后復查mNGS未見曲霉菌,但患者癥狀未消失,炎癥指標仍高,結合臨床繼續抗曲霉治療。另1例患者抗曲霉治療半月后mNGS未見曲霉菌,但患者癥狀未改善且炎癥指標及GM試驗均高,故繼續抗曲霉治療。1月后復查再現曲霉菌,但其序列數顯著降低,炎癥指標明顯好轉,GM試驗正常,綜合考慮繼續予抗曲霉治療10天后停藥。

表1 患者的臨床特點、實驗室指標及影像特征

表2 mNGS和傳統病原學方法陽性率比較[n(%)]

表3 肺曲霉感染組BALF的mNGS、培養和GM試驗陽性率比較[n(%)]

表4 mNGS對非中性粒細胞減少肺曲霉感染抗菌治療的指導作用[n(%)]

討 論

肺曲霉感染常發生于中性粒細胞減少等免疫缺陷宿主,但在非中性粒細胞減少的重癥患者中[8],肺曲霉感染比例攀升,因缺乏特異性臨床表現及早期精準的診斷手段,其病死率竟高于中性粒細胞減少患者[9]。迄今為止,用于肺曲霉感染的微生物學分析包括真菌涂片和培養、GM試驗、PCR、曲霉菌屬特異性免疫層析側流裝置試驗。其中GM試驗建議送檢BALF標本,其陽性高度傾向肺曲霉感染,陰性也有重要的排除價值[10],而血清GM試驗診斷效能偏低[11]。近期研究顯示,一種可溶性的識別受體正五聚蛋白3的多態性和曲霉的易感性呈正相關[12]。然而,這些檢測對肺曲霉感染的恰當初始治療和改善預后的指導作用有限。mNGS是一種新的微生物診斷方法,其微生物學適應證包括臨床懷疑新發病原體或特殊病原體感染;傳統病原學方法檢測出的病原體不能完全解釋臨床表現,疑似合并存在其它病原體感染;臨床懷疑感染,但傳統病原學方法未能檢測出病原體,經驗性抗感染治療療效欠佳;傳統病原學方法發現病原體,但臨床表現高度懷疑該病原體出現特殊的毒力表型。同時mNGS可通過發現菌種特異性的耐藥基因解決部分耐藥問題[13]。mNGS對曲霉菌有較高的診斷價值。目前關于mNGS與肺曲霉菌的研究甚少[14-16]。這些研究中,Chen等人[14]和Zhang等人[15]報道了mNGS在診斷曲霉菌和耶氏肺孢子菌共同感染中的應用,Zhang等人[15]和He等人[16]報道肺曲霉感染患者存在皮質類固醇治療的皮肌炎、COPD和哮喘等合并癥,這與我們的結果是一致的。

本研究回顧性評價了BALF的mNGS在非中性粒細胞減少肺曲霉感染中的診斷效能。比對臨床資料發現,與非肺曲霉感染組相比,咯血/痰血更多見于肺曲霉感染組,這與曲霉菌易侵犯血管引起出血或滲血有關,部分病人可出現大咯血窒息,故對有咯血或痰血的曲霉患者需提高警惕。肺曲霉感染組患者在全身應用皮質類固醇類藥物方面明顯多于非肺曲霉感染組,說明曲霉易感染免疫狀態較差的患者,故對應用激素、免疫抑制劑或合并慢性病的患者需加強曲霉菌檢測,警惕合并曲霉感染。

本研究通過對BALF中幾種檢測手段的比較發現mNGS的檢測效能明顯優于傳統病原學方法,BALF的mNGS較培養及GM試驗的診斷陽性率均高,且曲霉菌在核酸提取過程中屬于較難破壁微生物,不易被檢出,故即使檢出序列數低仍提示其為致病菌可能[13],說明mNGS是一種可信度較高的檢測技術。mNGS相對于其他微生物檢測方法的另一個優勢是鑒別的病原譜較廣,能同時鑒定出細菌、真菌及病毒等病原體,特別在少見菌及苛養菌的鑒別中更顯優勢。這項技術對混合感染或特殊感染的患者尤其獲益,故臨床診療中出現經驗性治療或據傳統病原學方法抗感染治療失敗時,可通過完善mNGS檢測排查有無混合感染或特殊感染的可能。當然,mNGS檢測的是病原核酸,并非病原微生物,故對檢出的多種病原體需綜合判斷其致病性,避免造成抗菌藥物的濫用而誘導其耐藥。mNGS無異常時還可輔助診斷肺部非感染性疾病,但仍需警惕原始樣本量少或病原微生物存在破壁困難造成的假陰性可能,必要時需復測mNGS或聯合其他病原學檢測手段聯合排查。再者,mNGS技術能有效指導抗菌治療[17-18]。在本研究中,76.5%患者初始的抗感染治療方案均未經驗性覆蓋真菌,而是依據mNGS結果開始抗曲霉治療。2例患者動態監測的mNGS結果提示,BALF中曲霉菌在抗曲霉治療中雖可能短暫轉陰,但仍不能松懈,需結合臨床表現及相關實驗室指標綜合判斷是否需繼續抗曲霉治療,否則曲霉感染仍有再次加重的風險,抗曲霉治療需長療程進行。故mNGS是診斷和精準抗曲霉治療的一項有利技術。

本研究存在以下不足:首先,這是單中心回顧性研究,因此內在偏倚不可避免。目前BALF的mNGS在非中性粒細胞減少肺曲霉感染中的研究很少,迫切需要多中心前瞻性大樣本研究。其次,由于缺乏對mNGS的普遍一致性解讀,故判定mNGS報道的微生物結果為感染還是定植菌,最終還必須經由熟悉微生物學知識的臨床專業人員參考臨床表現及其他化驗檢查進行歸類。最后,mNGS雖然高效,但高成本和高技術要求限制了其在臨床的廣泛應用。但mNGS對不能解釋的和嚴重的肺炎是一種有力診斷工具,而且除了診斷價值外,mNGS可應用于整個非中性粒細胞減少肺曲霉感染患者病程中曲霉負荷狀態的動態監測,從而可進一步檢驗抗曲霉治療的療效及評定抗曲霉治療療程。

BALF的mNGS對非中性粒細胞減少肺曲霉感染是一項高效的診斷方法,需被廣泛采用。在診斷混合感染和調整抗菌治療方案及療效評價方面優于其他檢測手段,這種新的方法有成為金標準的潛能。