阻斷PD-L1和MEK對非小細(xì)胞肺癌多細(xì)胞球體模型的治療作用

林吉興 云天洋 申磊磊 陳瑞驥 王柏霖 王鈺琦

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占所有肺癌的85%,多數(shù)患者被確診時已屬晚期;即使接受了根治性手術(shù)的患者,也很可能在幾年內(nèi)復(fù)發(fā)并全身轉(zhuǎn)移[1]。過去的20年中,化療一直是無基因突變的NSCLC患者唯一的治療方法[2]。近年來,隨著對免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞相互作用的進(jìn)一步認(rèn)識,免疫制劑抗細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)抗體藥物的療效已在多個不同的惡性腫瘤中得到證明[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路,可將多種增殖和分化的信號傳遞到細(xì)胞外環(huán)境,研究顯示,腫瘤細(xì)胞中的MAPK活性增強(qiáng)可通過miR-675-5p上調(diào)PD-L1表達(dá),而該通路的抑制可以通過抑制絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1,MEK1)和MEK2獲得[4-5]。本研究基于上述理論基礎(chǔ),探討抗PD-L1抗體阿特珠單抗(Atezolizumab)和MEK抑制劑司美替尼(Selumetinib)在NSCLC多細(xì)胞球體(multicellular spheroid,MTS)模型中的抗腫瘤作用。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

收集2019年1月～2020年1月在我院接受手術(shù)的NSCLC患者的腫瘤樣本,納入標(biāo)準(zhǔn):①有明確的NSCLC病理學(xué)診斷。②手術(shù)前未經(jīng)過放療、化療及其它免疫靶向治療。③通過酶消化法進(jìn)行處理,獲得體外MTS模型原代細(xì)胞培養(yǎng)。本研究方案經(jīng)醫(yī)院機(jī)構(gòu)評審委員會批準(zhǔn)(S2022-40);患者均于術(shù)前簽署書面知情同意書。

實(shí)驗(yàn)材料:10%優(yōu)級胎牛血清(GIBCO),司美替尼(AZD6244)和阿特珠單抗(MPDL3280A)均來自Med Chem Express,MEK、MAPK和PD-L1初級抗體(武漢普諾賽),山羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG和單克隆抗β肌動蛋白抗體(武漢艾美捷)。

二、檢測指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

1 定量實(shí)時PCR

使用Trizol試劑(Life Technologies)提取總RNA。按照制造商說明使用SensiFAST(Bioline)通過逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)將1μg分離的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。采用定量實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法分析PD-L1、IFN-γ、IL-12、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、TIM-3、CTLA-4、LAG-3基因的表達(dá)水平。利用PRIMER EXPRESS軟件(Applied Biosystems),所用引物(見表1)。使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)條件為50℃升溫2 min(S1),95℃變性10 min(S2),然后在95℃升溫15s,60℃升溫1 min循環(huán)40次(S3)。所有樣本一式兩份,使用QuantStudio 7 Flex實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行,基因的相對表達(dá)量歸一至18S,作為內(nèi)控基因;用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對表達(dá)值。通過解離曲線分析和使用非模板對照排除引物二聚體引起的非特異性信號。

表1 引物序列

2 蛋白質(zhì)印跡分析

溶出物在RIPA緩沖液[0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),0.5%脫氧膽酸鈉,1%NP-40裂解液,100mmol/L NaCl,10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TRIS HYDROCHLORIDE,Tris-HCl)(pH=7.4),0.5 mmol/L二硫三醇,0.5%苯甲基磺酰氟,蛋白酶抑制劑(Hoffmann-La Roche)]中均勻化,離心15000 rpm/4℃,用Bio-Rad法測定蛋白質(zhì)樣品,用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑ECL+檢測免疫復(fù)合物。每個實(shí)驗(yàn)一式三份。

3 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞儀表面染色,用染色緩沖液(staining buffer,SB)(2%FBS;0.1%硝基苯甲酸鈉)洗滌細(xì)胞,用20%SB+Ab血清阻斷10 min后,用小鼠單克隆抗體染色30 min。所用抗體為:抗MEK、MAPK和PD-L1(Miltenyi Biotec)。染色細(xì)胞洗滌2次,再懸浮于SB中,然后在FACS ACCURI C6(BD Biosciences)上獲得。使用Accuri C6軟件(BD Biosciences)進(jìn)行分析。用佛波醇-12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA,10 ng/mL)、放線菌素(500 ng/mL)和Brefeldin A(BFA 10 μg/mL)刺激6 h后,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生分析,用小鼠單克隆抗體IFNG(Miltenyi Biotech)培育T細(xì)胞。

4 NSCLC MTS模型的制備

根據(jù)以往研究中NSCLC MTS模型的培養(yǎng)方案[6],將所有新鮮的腫瘤組織樣品保存在冰上,并在收集當(dāng)天在無菌條件下進(jìn)行處理。將組織碎片按DeRose所述[7]在37°C搖瓶中以低速至中速(200r/min)消化,培養(yǎng)12h～18h后通過連續(xù)離心分離細(xì)胞。將細(xì)胞接種在基質(zhì)凝膠中以保留三維結(jié)構(gòu)。

5 細(xì)胞生存能力分析

細(xì)胞活力采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)法測定,按照Morgillo所述進(jìn)行MTS培養(yǎng)[8],MTT染色后用PBS-EDTA冷溶液從基質(zhì)中提取細(xì)胞,根據(jù)說明進(jìn)行裂解。通過劑量-響應(yīng)曲線插值確定IC50,每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)四次,使用三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的中位數(shù)作為結(jié)果,使用ComboSyn軟件計(jì)算協(xié)同作用。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、MTS模型中的培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)共成功建立7個三維培養(yǎng)基,成功率為63.6%(7/11),患者特征及三維培養(yǎng)建立率(見表2),在基質(zhì)凝膠中接種一周后,最小直徑90μm,在接下來的兩周內(nèi)繼續(xù)生長,以便進(jìn)行藥物測試。通過使用三種不同的過濾器(S1>100μm;S2 30～100μm;S3<30μm)過濾分離細(xì)胞,其中S3過濾球體的尺寸為最佳,將這一部分用于后續(xù)研究(見圖1)。

表2 患者特征及三維培養(yǎng)建立率[n(%)]

圖1 每次離心(S1、S2、S3)獲得球體模型的代表性圖像

二、MTS模型MEK、MAPK和PD-L1表達(dá)

對7個MTS模型進(jìn)行MEK、MAPK和PD-L1的蛋白質(zhì)印跡分析顯示,所有MTS模型MEK、MAPK和PD-L1均呈高表達(dá)水平(見圖2)。

圖2 MTS模型進(jìn)行PD-L1、MEK和MAPK的蛋白質(zhì)印跡分析,β-肌動蛋白作為對照

三、MTS模型對阻斷PD-L1和MEK的反應(yīng)

將7種MTS模型分為空白組、阿特珠單抗組、司美替尼組和阿特珠單抗+司美替尼聯(lián)合應(yīng)用組,結(jié)果阿特珠單抗組和司美替尼組產(chǎn)生中度抗增殖作用,司美替尼組組細(xì)胞死亡的中位數(shù)約為25%,阿特珠單抗組細(xì)胞死亡的中位數(shù)約為30%,聯(lián)合應(yīng)用組表現(xiàn)出高度抗增殖效果,細(xì)胞死亡的中位數(shù)約為45%(見圖3)。

四、阻斷PD-L1和MAPK MTS模型細(xì)胞因子表達(dá)

通過RT-PCR處理后,聯(lián)合組IFN-γ、IL-12和IL-6的表達(dá)顯著增加(P<0.05),IL-10、IL-1β和TNF-α無明顯變化(P>0.05),司美替尼和阿特珠單抗組所有細(xì)胞因子均無明顯升高(P>0.05)(見圖4)。

圖3 MTS模型對阻斷PD-L1和MEK的反應(yīng)

圖4 阻斷PD-L1和MAPK MTS模型細(xì)胞因子表達(dá)注:與未處理組比較,**P<0.01;***P<0.001

圖5 阻斷PD-L1和MAPKMTS模型免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)注:與未處理組比較,**P<0.01;***P<0.001

五、阻斷PD-L1和MEK的MTS模型免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)

RT-PCR處理后,聯(lián)合組PD-L1和CTLA-4表達(dá)顯著減少(P<0.05),TIM-3和LAG-3無明顯變化(P>0.05),司美替尼和阿特珠單抗組PD-L1表達(dá)顯著減少(P<0.05),CTLA-4、TIM-3和LAG-3表達(dá)均無明顯下降(P>0.05)(見圖5)。

討 論

針對PD-L1的免疫抑制劑改善了NSCLC患者的生存率,然而PD-L1表達(dá)和治療獲益之間的差異也經(jīng)常出現(xiàn)。有研究表明,肺腺癌細(xì)胞中生長因子依賴的MAPK信號在IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)中起重要作用,MEK1/2抑制劑可降低IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá),增加肺腺癌細(xì)胞的免疫原性[6-7]。多項(xiàng)針對不同惡性腫瘤的動物實(shí)驗(yàn)顯示,抑制MEK可通過防止T細(xì)胞凋亡,降低骨髓抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平來增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng),當(dāng)與PD-L1/PD-1阻斷治療結(jié)合時,可造成持續(xù)性的腫瘤抑制[8-9]。

在抗PD-L1藥物中,阿特珠單抗是一種工程化IgG抗體,其修飾的FC結(jié)構(gòu)域可防止抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性,已被FDA批準(zhǔn)用于NSCLC的二線治療[10]。有研究顯示[11],阿特珠單抗相比多西他賽化療延長了治療組和PD-L1陽性患者的生存率,說明無論P(yáng)D-L1表達(dá)如何,阿特珠單抗均能顯示出一定的臨床療效。MAPK通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路,能夠?qū)⑸砩隙嘀卦鲋澈头只男盘杺鬟f至細(xì)胞外環(huán)境。在腫瘤疾病中MAPK常會上調(diào),導(dǎo)致不受控制的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成。臨床前模型表明,靶向MAPK途徑能在更廣泛的程度上影響腫瘤生長。抑制MEK1和MEK2可抑制MAPK通路[12],司美替尼是一種強(qiáng)效和高選擇性的MEK抑制劑,目前與BRAF抑制劑威羅菲尼聯(lián)合應(yīng)用于晚期BRAF突變的黑色素瘤患者[13]。此外,MAPK與免疫抵抗有關(guān),抑制MEK可通過向腫瘤部位召集免疫細(xì)胞來轉(zhuǎn)化其它耐藥腫瘤[14]。

本研究使用體外多細(xì)胞培養(yǎng)物證明MEK抑制劑和抗PD-L1藥物在NSCLC細(xì)胞死亡方面具有顯著的協(xié)同作用。這種協(xié)同作用是MEK抑制劑對癌細(xì)胞的直接作用的結(jié)果,以及所有能夠維持免疫反應(yīng)和炎癥微環(huán)境的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用。有研究證明[15-16],在KRAS突變細(xì)胞中PD-L1上升,但對造成這種情況的下游途徑?jīng)]有完全闡明。Gao等[17]通過ERK信號證實(shí)KRAS突變背景下PD-L1的上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn),STAT 3參與了RAS/MEK引起的PD-L1轉(zhuǎn)錄調(diào)控,為MEK抑制劑和抗PD-L1抑制劑的結(jié)合提供了另一個機(jī)制[18]。Liu等[19]研究顯示,在KRAS突變的NSCLC中,在蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄譜方面存在不同的亞組,包括對抗PD-1/PD-L1免疫治療耐藥的KRAS/LKB1突變患者,免疫和炎癥標(biāo)志物表達(dá)低的KRAS/LKB突變患者,以及對單一免疫治療更敏感的KRAS/TP53突變患者。我們推測,在抗PD-1/PD-L1的基礎(chǔ)上加入MEK抑制劑對KRAS突變的患者也有幫助,也可以提高他們對免疫治療的敏感性。

使用患者特異性衍生MTS模型可以研究腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用,識別概括人類白細(xì)胞抗原和T細(xì)胞受體的特異性[20],此外,通過類器官模型可對不同細(xì)胞成分的蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)進(jìn)行研究,鑒定參與治療敏感性或抗性的分子途徑[21]。本研究證實(shí),體外腫瘤類器官培養(yǎng)物可用于建立個體化模型以評估MEK抑制劑和抗PD-L1抗體治療的效果,說明MTS是一個可重復(fù)、簡單和廉價的模型,可以復(fù)制和預(yù)測體內(nèi)臨床數(shù)據(jù),用于在臨床前環(huán)境中測試任何免疫治療藥物的效果。MEK抑制劑和抗PD-L1抗體在全球范圍內(nèi)廣泛用于惡性腫瘤的治療,本研究為今后相似的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)提供了思路和理論依據(jù)。

綜上所述,腫瘤的免疫治療需要新的組合策略來預(yù)防和克服對單一療法的耐藥性,并尋找能夠預(yù)測其敏感性的腫瘤標(biāo)記物。本研究確定了抗PD-L1抗體與MEK抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的基本原理,在NSCLC的MTS模型中,雙重阻斷MEK與PD-L1具有優(yōu)于單一抑制的療效。