《傷寒論》方治療糖尿病腎病的數據挖掘及核心藥物的網絡藥理學研究*

吳偉,樊啟輝,黃艷麗

江西中醫藥大學附屬醫院,江西 南昌 330000

糖尿病腎病是糖尿病的主要并發癥之一[1-2],其發病機制尚不完全清楚[3],終末期會導致腎功能衰竭。張仲景《傷寒論》以六經鈐百病[4],有關《傷寒論》方治療糖尿病腎病的臨床和實驗研究較多,但尚無此類研究的數據挖掘報道。筆者通過數據挖掘,總結糖尿病腎病的六經辨證特點,藥物運用規律,發現核心藥物;結合核心藥物的網絡藥理學分析,推測疾病的發病規律,為糖尿病腎病的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源選取中國學術期刊全文數據庫(中國知網)、萬方數據庫、中文科技期刊數據庫(維普),中國生物醫學文獻數據庫(CBM)、英文數據庫Pubmed中關于《傷寒論》方治療糖尿病腎病的文獻。

1.2 文獻納入及排除標準納入《傷寒論》單方、合方治療糖尿病腎病的臨床研究、動物實驗研究文獻;排除一般性綜述、循證研究、細胞實驗研究、其他聯合用藥研究及雷同文獻。

1.3 資料檢索與收集兩名研究者以《傷寒論》112首方劑“方名”如“桂枝湯”或“六經”“經方”“傷寒論”和“糖尿病腎病”為檢索詞檢索中文數據庫,以英文方名如“Guizhi Decoction”和“diabetic nephropathy”為檢索詞檢索英文數據庫,檢索時間均為建庫至2021年12月31日。剔除不符合要求文獻,制作Excel表,橫目錄標題為臨床研究、動物實驗研究,縱目錄標題為112首方劑方名和合方名。

1.4 數據分析方法數據采用Excel表、SPSS 24.0、SPSS Modeler 18.0、云圖匯等工具進行分析。累積條圖呈現各方劑研究頻數及類型分布;桑基圖展示所納入方劑在六經病的分布比例;熱力圖發現核心應用的藥物;太陽輻射圖分析藥物的四氣五味、歸經特征;關聯規則分析藥物間的關聯度;聚類分析觀察藥物間的聚集模式;環形圖呈現方劑對應原文證候分布;關系圖展示藥物與證候間的聯系;堆疊玉玨圖發現納入方劑的療效;云雨圖發現藥物的劑量規律。網絡藥理學用TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、Genecards等數據庫篩選活性成分及疾病靶點,運用Cytoscape 3.9.0軟件繪制互作圖發現疾病-成分-靶點關系,Metascape數據庫進行基因本體(gene ontology,GO)、京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析探討其作用機制。

2 結果

2.1 文獻檢索結果及特征初步檢索中文文獻387篇,英文文獻2篇,逐一篩選,最終納入17篇文獻,均為中文,其中動物實驗研究5篇[5-9],臨床研究12篇[10-21]。所用方劑有大黃黃連瀉心湯、五苓散、真武湯、抵當湯、葛根芩連湯、五苓散合四逆湯、小柴胡湯、小陷胸湯、芍藥甘草湯、苓桂術甘湯、桂枝湯、桃核承氣湯等。

2.2 六經病分布各方劑所治療病證以太陽病最多,共出現12次,陽明病出現5次,厥陰病出現2次,少陽病、太陰病、少陰病、太陽合陽明病、太陽合少陰病、太陽合厥陰病、陽明合少陰病、陽明合厥陰病各1次,具體見圖1。

圖1 各方劑治療六經病的桑基圖

2.3 藥物頻次分析所有納入的方劑共23味中藥,應用頻率在前20%的藥物分別是甘草、桂枝、茯苓、白術,見圖2。

圖2 各方劑中藥物頻次熱力圖

2.4 藥物四氣五味、歸經分析藥物四氣以寒性居多,五味以苦味、甘味、辛味居多,歸經依次為脾經、胃經、肺經、心經、肝經,見圖3。

圖3 藥物四氣五味、歸經太陽輻射圖

2.5 藥物關聯設定最小支持度10%,最小置信度80%時,獲得兩藥和三藥的關聯規則。置信度100%時,最大支持度的藥對是白術和茯苓;置信度80%時,最大支持度的藥對是桂枝和甘草;置信度100%時,最大支持度的三藥是白術、茯苓和桂枝。見表1、表2。

表1 兩種藥物關聯規則

表2 三種藥物關聯規則

2.6 藥物聚類聚類圖以標尺值10為界點,將藥物分成七類,具體見圖4。第一類:柴胡、人參、大棗、生姜、半夏、瓜蔞,功效:和解少陽,兼扶土氣;第二類:葛根、黃連、黃芩,功效:解太陽表邪,清陽明里熱;第三類:水蛭、虻蟲、桃仁、芒硝、大黃,功效:攻瘀逐熱,清降陽明;第四類:白芍,功效:養血斂陰;第五類:附子、干姜、茯苓、白術、澤瀉、豬苓,功效:溫腎利水,少陰太陽同治;第六類:桂枝,功效:散寒解肌,通陽化氣;第七類:甘草,功效:益氣健脾,調和諸藥,補中央土氣斡四方。

圖4 藥物聚類圖

2.7 證候與藥物關聯涉及的原文證候共36種,以發熱最多,見圖5。

圖5 證候分布圖

2.8 療效分析納入文獻中共有療效指標40種,其中真武湯療效指標最多;研究頻數前20%的指標有血肌酐、24 h尿蛋白、尿素氮、內生肌酐清除率、有效率、腎臟病理、中醫證候、空腹血糖,見圖6。治療組能降低血糖、減少24 h尿蛋白、改善腎組織損傷、提高腎功能、改善中醫證候、提高有效率等。

圖6 各方劑療效的堆疊玉玨圖

2.9 藥物劑量分析附子、半夏、生姜、大棗用量較固定:附子一枚,半夏半升,生姜3兩,大棗12枚。藥物劑量離散度分析,白芍劑量相對最集中,茯苓最離散,中位數以白芍劑量最大,見圖7。

圖7 各藥物劑量的云雨圖

3 網絡藥理學研究

3.1 活性成分篩選結果利用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索高頻核心藥物甘草、桂枝、茯苓、白術有效成分,并限定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18。將所得有效成分通過其化學名在有機小分子生物活性數據庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)進行搜索,得到各成分簡化分子線性輸入規范(SMILES)。

3.2 化學成分靶點預測結果將搜索到的SMILES式通過Swiss Target Prediction 服務器虛擬篩選,共得到核心藥物成分靶點基因754個。篩選活性成分-靶點關系度≥20%,獲得活性成分桂枝2個,茯苓8個,白術1個,甘草30個,靶點基因146個,成分-靶點關系434個。

3.3 疾病靶點獲取在Genecards(https://www.genecards.org/)數據庫中檢索“diabetic nephropathy”,得出糖尿病腎病相關靶點,以相關性分數≥10作為篩選條件,篩選結果作為疾病的候選靶點基因,共406個。

3.4 成分-靶點網絡構建將得到的成分-靶點關系以Excel格式導入Cytoscape 3.9.0軟件中,設置網絡節點、邊等基本屬性,得到成分-靶點網絡圖,見圖8。41個節點代表活性成分,146節點代表與活性成分相關的靶點基因。以節點度degree值反映靶點大小,節點度>10的成分有GC3(Mairin)、GC30(Licochalcone B)、GC22(kanzonols W)、GC6(Medicarpin)、GC4(Glycyrol)、FL4(Cerevisterol)、FL7(Ergosterol peroxide)、GZ1(taxifolin)、GZ2(beta-sitosterol),節點度>10的靶點有PTPN1、CYP19A1。

圖8 成分-靶點網絡圖

3.5 蛋白相互作用(PPI)網絡構建利用韋恩圖得到成分和疾病共有的潛在靶點29個,導入STRING獲得蛋白相互作用,信息導入Cytoscape 3.9.0軟件繪制蛋白相互作用(PPI)網絡,進行網絡拓撲結構分析,以combined score值反映邊的粗細,以節點degree值反映靶點大小及顏色,從而構建蛋白互作網絡,見圖9。

圖9 蛋白相互作用網絡

3.6 疾病-成分-靶點網絡利用 Cytoscap 3.9.0中的merge功能將成分-靶點網絡和蛋白相互作用網絡合并,得到的疾病-成分-靶點網絡為兩個網絡的重疊部分,見圖10。

圖10 疾病-成分-靶點網絡

3.7 GO和KEGG分析利用Metascape(https://www.metascape.org/)數據庫對共同靶點進行GO分析,見圖11,生物過程主要涉及肽的反應、平滑肌細胞增殖的調節、細胞酮代謝、細胞對化學應激的反應、炎癥反應的調節等過程;細胞組分主要涉及膜側面、溶解液泡、轉移酶復合物、細胞外基質、膜筏等組分;分子功能主要涉及激素結合、核受體活性、脂肪酸結合、磷酸酶結合、絲氨酸內肽酶結合等功能。進行KEGG通路富集分析,見圖12,通路涉及腫瘤通路、腺苷酸激活蛋白激酶信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。

圖11 GO分析圖

圖12 KEGG通路富集分析圖

4 討論

本研究納入的文獻類型有動物實驗研究和臨床研究,5項動物實驗研究中結局指標均有腎臟病理結果,病理結果示腎小球體積增大、腎小球系膜基質增寬、基底膜廣泛增厚等,與人類早期糖尿病腎病病理改變一致[22]。

糖尿病腎病的六經辨證中,以太陽病最常見,其次是陽明病。太陽陽氣最盛,為六經之藩籬,統攝營衛[23-24]。王肯堂《證治準繩》曰:“人之一身,本乎營衛”,營衛正常則病不生,營衛氣亂則病起,故糖尿病腎病也常從太陽病論治。藥物頻次分析發現核心藥物是甘草、桂枝、茯苓、白術,桂枝辛溫補陽從皮毛散寒,同時補火制水;茯苓入肺、脾、腎經,防桂枝辛溫太過;白術入脾胃經,補后天之本;甘草健脾胃,調和諸藥[25-27]。

藥物關聯分析中白術、茯苓關聯度最大,二藥合用,一補一滲,益氣健脾滲濕,以復中焦運化之職;白術、茯苓配伍桂枝,桂枝溫陽化氣以行水,溫脾、利水之力增強。桂枝配甘草,辛甘化陽,補益之力倍增,祛邪之力更強。聚類分析第一類為小柴胡湯方中藥物,用瓜蔞代替黃芩潤腸泄熱,清熱同時加強通腑之力;第二類為葛根芩連湯方中藥物,辛涼與苦寒同用,解表又清里;第三類為抵當湯方中藥物,合用芒硝以增強泄熱之功;第四類藥物為白芍,白芍乃養陰柔肝第一藥,柔肝可熄風;第五類為四逆湯合五苓散方中藥物,水為陰邪,賴陽氣化之,陽氣通達,則水濕得化,一補一瀉,補而不留邪,瀉而不傷正;陽虛有寒用桂枝,桂枝溫陽化氣,散寒解表,兼補散于一體。中氣不足,脾失健運用甘草,甘草補中,調和諸藥。

核心藥物的網絡藥理學發現,甘草治療糖尿病腎病的活性成分有30個,關鍵成分有白樺脂酸、甘草查耳酮B、康唑醇W、美迪紫檀素、甘草醇5個;茯苓的活性成分有8個,關鍵成分有腦甾醇、過氧化麥角甾醇2個;桂枝的活性成分有2個,關鍵成分分別是紫杉葉素、β-谷甾醇;其中以甘草的白樺脂酸、甘草查耳酮B、康唑醇W作用最顯著。有研究顯示,白樺脂酸有降糖、減少氧化應激、抗炎、維持線粒體穩定、抗凋亡的作用[28-31]。糖尿病腎病發病機制復雜,與高血糖、氧化應激、炎癥反應等多因素相關,白樺脂酸可以從多個靶點保護腎臟。核心藥物治療糖尿病腎病的潛在靶點有29個,其中以非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1、細胞色素P450超家族芳香化酶19A1為關鍵靶點。有研究發現,非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1可以使PI3K/Akt上游分子IRS1發生去磷酸化,從而抑制胰島素信號通路的傳導,參與胰島素抵抗[32-33]。細胞色素P450超家族芳香化酶19A1基因多態性與糖代謝相關,推測非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1與細胞色素P450超家族芳香化酶19A1可以從糖代謝途徑保護腎臟。GO分析生物過程肽的反應最強烈,細胞組分膜側面最突出,分子功能激素結合反應最常見。KEGG分析發現,除腫瘤通路外,腺苷酸激活蛋白激酶信號通路最活躍。