枸杞根腐致病菌及拮抗菌的分離鑒定

朱 杰,程 亮,3,姚 強,3,李秋榮,陳紅雨,3,郭青云,3

(1.青海大學 農林科學院,西寧 810016;2.青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室,西寧 810016;3.西寧農業農村部作物有害生物科學觀測實驗站,西寧 810016)

枸杞是茄科植物(Lyciumbarbarum),它不僅是中國傳統的珍貴中藥材,還被中國批準為藥食同源的首批產品之一[1]。病害的發生會導致枸杞的產量及品質遭受嚴重的破壞[2],枸杞根腐病是青海省栽培枸杞林的主要病害之一,發病率高達53.2%以上,近幾年還呈現逐步上升的趨勢[3]。枸杞根腐病是一種全株性的系統病害,整個生育期都可發病,在青海省德令哈市、都蘭縣、諾木洪縣、格爾木縣和寧夏、內蒙古、新疆均有分布[3]。據報道,枸杞根腐病的致病菌約有9種:尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、同色鐮刀菌(F.concolor)等[3-4],其中以尖孢鐮刀菌致病力最強。尖孢鐮刀菌屬于鐮刀菌屬土傳真菌,該菌引起的病害很難防治[5],其原因有:寄主植物根際分泌物會刺激尖孢鐮刀菌孢子萌發和芽管生長[6];該菌會分泌細胞壁降解酶(CWDEs)和毒素進行侵染[7],其鐮刀菌酸(FA)和伏馬菌素(FB)等毒素會干擾宿主呼吸,損害宿主的抗病反應[8];鐮刀菌具有逃避植物防御的調控基因[9],還有很強的環境適應能力[10]。

目前,防治枸杞根腐病害以培育種植抗病品種和使用化學藥劑為主[11]。中國農業種植中過度使用農藥,不僅污染環境,還威脅人類健康發展[12],而生物防治可以有效解決病原菌抗性、再猖獗以及農藥殘留等問題,同時還能促進綠色農業發展[13]。從植物根際土壤中分離出的生防菌在植物體表及土壤具有一定的定殖能力[14]。相比真菌和放線菌,生防細菌種類和數量繁多,繁殖速度較快,還能產生特有的細菌素[15]。生防細菌可以通過競爭作用,產生抑菌物質,誘導植物產生系統抗病性等方式有效抑制病原菌的危害[14]。Katz等[16]發現芽孢桿菌可以產生脂肽類、蛋白酶等以降解病原菌細胞壁。Balthazar等[17]發現芽孢桿菌可以誘導寄主植物激活自身的防御基因以此來響應病原菌的侵入。本試驗分離鑒定枸杞根腐病病原菌后,以此為靶標,篩選具有拮抗效果的生防細菌,明確其種類,為枸杞根腐病的生物防治提供菌種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

病樣采集:于2019-2021年 6-8 月從青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣(97°01′99.27″E,36°19′37.20″N,海拔 3 285 m);都蘭縣諾木洪(98°09′98°13″ E,36°30′36.39″N,海拔3 180 m);德令哈市柯魯柯鎮(90°07′99.46″E,35°01′39.19″N,海拔2 942 m) 采集具有典型枸杞根腐病病害癥狀的植株根莖部各10份,對其利用組織分離法分離純化病原菌株,并對植株病害癥狀描述記錄。

土壤樣本:從青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣(97°01′99.27″E,36°19′37.20″N,海拔 3 285 m)栽培枸杞林中發病與未發病植株根際采集土壤樣本各5份,利用稀釋平板法對土樣中細菌進行分離純化,編號保存。

1.2 病原菌形態特征觀察

將分離純化后的菌株轉移至PDA平板, 25 ℃恒溫培養,直接觀察并記錄病原菌的菌落顏色、形態,生長速率;在顯微鏡下測量和記錄菌絲、分生孢子的形態、分隔、大小。

1.3 病原菌分子生物學鑒定

選擇形態鑒定后具有代表性的菌株,利用真菌試劑盒提取病原菌的DNA,選用引物ITS1/ITS4擴增基因間隔序列(ITS);引物EF-1H/EF-2T擴增翻譯延伸因子基因序列(TEF-1α)(表1)。PCR反應體系(20 μL):正,反向引物 (10 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板 1 μL,2×PCR Mix 10 μL,dd H2O 8 μL。反應程序如下。

表1 所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

ITS:99 ℃預變性5 min,95 ℃變性45 s, 58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環,最后72 ℃延伸5 min。

TEF-1α:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,52 ℃退火45 s,68 ℃延伸50 s,35 個循環,最后68 ℃延伸5 min。

擴增產物提交楊凌天潤奧科生物科技有限公司測序。測序結果與NCBI 數據庫及GenBank 中已知序列進行相似性比對分析,再使用 MEGA 6.0 軟件將目的序列與模式菌株進行多重比對,選用K2模型和鄰近法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹,確定分離菌株的種屬分類地位。

1.4 柯赫氏法則驗證

按柯赫法則(Koch postulates) 進行驗證,使用兩年生枸杞苗,栽植于無菌營養土,放置于溫室,提供適合菌株生長的溫度和水分。將根莖處韌皮部用無菌刀片劃開2～3 cm,取與傷口同面積的菌絲于劃傷處,并用濕潤的滅菌棉花包裹,使傷口處保持水膜狀態。每個重復處理 3株,待發病后,觀察發病癥狀,并取發病組織再次進行分離純化,最后與接種菌株進行比較。

1.5 生防細菌的篩選

利用平板對峙法,將分離得到的細菌與病原菌分別置于NA、PDA培養基上,25 ℃恒溫培養。于PDA平板中央接種直徑為0.5 cm的病原菌菌餅,距離餅2.5 cm處用接種針點接細菌,以只接病原菌的PDA平板為對照,設置3次重復,培養7 d后觀察細菌株對病原菌菌絲生長的抑制效果。其中以尖孢鐮刀菌為靶標菌進行初步篩選,再利用尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌做為靶標菌進行復篩得到抑制率。

病原菌生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.6 生防細菌的形態學鑒定

在NA培養基上,28 ℃恒溫培養目的菌株 48 h,觀察其菌落形態特征,并進行革蘭氏染色。

1.7 生防細菌的分子生物學鑒定

利用細菌試劑盒提取生防菌的DNA,用引物進行PCR擴增,選用引物為:27F/1492R、UP1-F/UP-2R。分別擴增16S rDNA和GyrB基因序列,引物序列見表1。PCR反應體系同“1.3”,反應程序如下。

16S rDNA:95 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個循環;72 ℃延伸10 min。

GyrB:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性45 s, 60 ℃退火45 s,72 ℃延伸80 s,35個循環;72 ℃延伸10 min。

PCR 擴增產物和基因序列處理同“1.3”。

1.8 數據處理

所得數據用 DPS V9.01、SPSS 18.0軟件進行方差分析和顯著性分析。根據處理的數據用Microsoft Excel 2010制作圖表。

2 結果與分析

2.1 枸杞根腐病病樣的采集及分離結果

從青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣、德令哈市柯魯柯鎮、都蘭縣諾木洪栽培枸杞林采集的病樣中共分離獲得23株真菌。采集的病樣癥狀為:植株地上部分無明顯病變,感病較重的植株葉片變黃脫落;于植株根莖處,撥開韌皮部,可見褐色病變及白色霉層,嚴重時伴有腐爛(圖1)。

圖1 采集的枸杞根腐病樣癥狀Fig.1 L.barbarum root rot-like symptoms

2.2 病原菌形態特征觀察

根據在PDA平板上的形態對分離得到的23株真菌進行分類,共分為4種,分別為A類(G6-1,G6,GA-9-2)、B類(G6-2,GB-2-2,GB-2-3)、C類(G2-2,GA-2)、D類(LG-1,LG-1-1,LG-1-2,LG-1-3,LG-2,LG-3,LG-4,LG-5,LG-6,LG-6-1,G9-2,GA-3,GA-3-4,GB-6,GB-6-2),另選取D類中5株具有代表性的菌株(LG-4,LG-3,LG-1-3,LG-1-2,LG-6-1)進行分子生物學鑒定,以上4類真菌的形態學特征如下。

2.2.1 A類 菌絲稀疏,菌落正反面初期為中間深紅,四周淺紅,氣生菌絲氈絮狀,后期菌落中心開始出現黃色,7 d可長滿整個皿。其分生孢子中間彎曲不明顯,兩端分隔細胞稍尖,3～5個隔膜,大小為6.90～14.73 μm,菌絲直徑平均約為1.40～2.65 μm,產孢細胞直接生長在菌絲上,為單瓶梗(圖2)。初步鑒定為黃色鐮刀菌(F.culmorum)。

A1/A2.菌落正/反形態;A3/A4.分生孢子及孢子梗形態;A5.厚垣孢子形態;A6.菌絲形態

2.2.2 B類 菌絲致密,菌落正面中心白綠,外圍紫紅色/黃色。中間與外圍菌絲有明顯分界線,背面菌落中心呈米黃色,外圍淡褐色,7天可長62.32 mm。小型分生孢子呈檸檬形/梨形/瓜子形,大型分生孢子1～3個隔膜,平均4.07～7.01 μm,菌絲直徑約為2.5～7.5 μm(圖3)。初步鑒定為三線鐮刀菌(F.tricinctum)。

A1/A2.菌落正/反形態;A3/A4/A5.分生孢子及孢子梗形態;A6.小型分生孢子形態

2.2.3 C類 菌絲稀疏,部分菌落有輪紋,呈氈絮狀,7 d可長78.48 mm,菌落正面白色/淡粉色,背面白色/淡粉色,菌絲直徑平均約為1.6～3.5 μm。小型分生孢子卵型,大型分生孢子分隔 1～3個,平均大小為16.56～20.91 μm,產孢類型為單生(圖4)。初步鑒定為木賊鐮刀菌(F.equiseti)。

A1/A2.菌落正/反形態;A3.菌絲形態;A4/A5.分生孢子及孢子梗形態;A6.小型分生孢子形態

2.2.4 D類 菌絲致密,隆起;氈絮狀,后期簇狀,微濕;菌落圓形,表面干燥,不透明,正面白色或菌落正面中心嫩黃色,背面膚色,邊緣白色或嫩黃色。菌絲長勢較慢,7 d可長38.11 mm,菌絲直徑平均約為1.56～3.16 μm。其小型分生孢子數量多,橢圓形,0～1 分隔,多數無隔,平均大小約為7.34～10.89 μm,單生(單瓶梗產孢,產孢梗短)及假頭狀聚生(圖5)。初步鑒定為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

2.3 病原菌分子生物學鑒定

經同源性比較分析后發現,基于rDNA-ITS基因序列所測長度為510～560 bp,TEF-1α基因所測序列長度為660～690 bp。將病原菌的5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列(ITS)和翻譯延伸因子基因序列(TEF-1α)聯合構建系統發育樹,結果表明:菌株GB-2-3、G6-2、GB-2-2與三線鐮刀菌(F.tricinctum)模式菌株Z5(EF611092.1)和WAC:12337(JF776666.1)以100%序列相似性聚為一枝,菌株LG-4、LG-3、LG-1-3、LG-1-2、LG-6-1以100%序列相似性與尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)模式菌株ATCC 34298(DQ452454.1/ DQ452431.1)和ATCC 16416(DQ452450.1/ DQ452427.1)聚為一枝,菌株GA-2、G2-2與木賊鐮刀菌(F.equiseti)模式菌株NRRL 26419(NR_121457.1/GQ505599.1)以100%相似性聚在一枝,菌株GA-9-2、G6-1、G6與黃色鐮刀菌(F.culmorum)模式菌株EI3b(KC311482.1)和WN75(GU370481.1) 以100%序列相似性聚為同一枝(圖6)。

T.模式種,下同

綜上,可將菌株GB-2-3、G6-2、GB-2-2鑒定為三線鐮刀菌(F.tricinctum),菌株LG-4、LG-3、LG-1-3、LG-1-2、LG-6-1鑒定為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum),菌株GA-2、G2-2鑒定為木賊鐮刀菌(F.equiseti),菌株GA-9-2、G6-1、G6鑒定為黃色鐮刀菌(F.culmorum)。

2.4 柯赫氏法則驗證

從枸杞根腐病病株上共分離出 23 個菌株,經形態學和分子生物學鑒定后對其進行柯赫氏法則驗證。選取健康的2 a生枸杞苗進行試驗發現,接種清水對照(圖7-E)未發病,接種尖孢鐮刀菌、三線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、黃色鐮刀菌的植株發病,且發病情況與取樣時的病癥相似。

A.接種黃色鐮刀菌;B.接種三線鐮刀菌;C.接種木賊鐮刀菌;D.接種尖孢鐮刀菌;E.接種清水

接種黃色鐮刀菌的植株葉尖變黃;接種部位有些許白色霉層,向上延伸,病部未見明顯的變色(圖7-A)。接種三線鐮刀菌的植株葉片顏色和形態均無明顯變化;接種部位變成黑褐,向上延伸,維管束中央呈紅色病變,與正常維管束顏色差距較大(圖7-B)。接種木賊鐮刀菌的植株葉片無黃化現象。接種部位發生黃褐色病變,維管束組織呈現淺褐色(圖7-C)。接種尖孢鐮刀菌的植株維管束無明顯變化,葉上部無明顯變化,接種部位發成黃褐色病變,有明顯白色霉層(圖7-D)。

對病部進行再分離,鑒定,能獲得與原接種菌株形態及種類一致的病原菌。根據柯赫氏法則驗證,試驗中的尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌均為枸杞根腐病的病原菌。

2.5 生防細菌的篩選

2.5.1 初篩結果 從土壤中分離到660 株細菌菌株,以尖孢鐮刀菌為靶標利用平板對峙法初步篩選每株細菌的拮抗效果(圖8),發現:對尖孢鐮刀菌有拮抗作用的有8株,分別是QH-664、QH-667、QH-668、QH-588、QH-001、QH-468、QH-400和QH-390。

圖8 拮抗細菌初篩Fig.8 Preliminary screening of antagonistic bacteria

2.5.2 復篩結果 利用4種枸杞根腐病原菌為靶標進行復篩,結果發現:QH-668、QH-667、QH-664、QH-588、QH-468、QH-400、QH-001和QH-390這8株生防菌對黃色鐮刀菌、三線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌均具有抑制效果;其中菌株QH-588對這4株病原菌的抑制效果最好,抑制率依次為:45.95%、36.09%、41.52%、51.79%;其次是菌株QH-468和QH-001。另外,菌株QH-668、QH-667、QH-664對病原菌的抑制率相差不大,抑制率較小的為菌株QH-400和QH-390(表2)。

表2 生防菌復篩抑制率Table 2 Re-screening inhibition rate of biocontrol bacteria

2.6 生防細菌的形態學鑒定結果

菌株QH-588、QH-668、QH-667、QH-664、QH-468、QH-001、QH-400和QH-390的革蘭氏染色均為紫色,表明這8株生防細菌均為革蘭氏陽性菌(圖9-i-9-p)。除菌株QH-400、QH-390菌落在NA培養基上透明,呈白色,泛青,表明干燥外(圖9-b,9-c),其余菌株的菌落在NA培養基上均為乳白色,不透明,邊緣不規則,表明不光滑(圖9-a,9-d-9-h)。經形態學初步鑒定菌株QH-400、QH-390為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

a、b、c、d、e、f、g、h依次分別為QH-001、QH-390、QH-400、QH-468、QH-588、QH-664、QH-667、QH-668的菌落形態;i、j、k、l、m、n、o、p.依次分別為QH-001、QH-390、QH-400、QH-468、QH-588、QH-664、QH-667、QH-668的革蘭氏染色

2.7 生防細菌的分子生物學鑒定

將生防細菌的16S基因序列和GyrB基因序列聯合構建系統發育樹,結果表明:菌株QH-468、QH-668、QH-664、QH-001、QH-667與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)模式菌株BCRC10255(NR_116017.1/DQ309293.1)以100%序列相似性聚為一枝,菌株QH-588以100%序列相似性與萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)模式菌株BCRC 17123(EF433409.1/DQ309296.1)聚為一枝,菌株QH-390、QH-400與短小芽孢桿菌(B.pumilus)模式菌株ATCC 7061(NR_043242.1/JN575338.1)以100%相似性聚在一枝(圖10)。綜上,可將菌株QH-001、QH-468、QH-664、QH-667、QH-668鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis);菌株QH-390、QH-400鑒定為短小芽孢桿菌 (B.pumilus);菌株QH-588鑒定為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

圖10 基于 16S和GyrB基因序列聯合構建生防菌菌株的系統發育樹Fig.10 Phylogenetic tree of biocontrol bacterial strains based on 16S and GyrB gene sequence

3 討 論

枸杞根腐病是青海省栽培枸杞林的主要病害之一,通過分離鑒定發現海西蒙古族藏族自治州枸杞根腐病原菌有:三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌4種,分離比分別為: 13.04%、13.04%、65.22%、8.70%,其中以尖孢鐮刀菌為主。這與寧夏和甘肅靖遠縣分離出的枸杞根腐病主要致病菌一致[2,19]。據報道,枸杞根腐病的致病菌約有9種:尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、同色鐮刀菌(F.concolor)、串珠鐮刀菌(F.monilifome)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum) 、黃色鐮孢(F.culmorum)、木賊鐮刀菌 (F.equiseti)、寄生疫霉(Phytophthoranicotianae)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)[3-4],本研究鑒定出的三線鐮刀菌為首次報道。鐮刀菌分布極其廣泛,能危害多種作物。除枸杞根腐病以外,鐮刀菌屬中的三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌同時能引起馬鈴薯干腐病[22]、苜蓿根腐病[23]等。鐮刀菌不僅能分泌毒素進行侵染,在伴隨谷物生長時,還會產生玉米赤霉烯酮、單端孢霉烯族化合物、丁烯酸內酯[24]等毒素,這些毒素對人類的健康具有很大的威脅。人們發現在生防菌的抑制作用過程中,病原菌會通過各種途徑緩解生防菌的抑制[25]。生物防治目前是防治鐮刀菌病害的有效手段,如衛傳昊等[26]發現生防菌GHt-q6發酵液對尖孢鐮刀菌的抑制率可達78.38%,張小彥[3]發現中華根瘤菌和綠僵菌對枸杞根腐病原中的腐皮鐮刀菌抑制率分別為52.29%和 39.80%。傳統的生物防治大多采用單一菌株防治單一病害,但生防菌使用中會出現適應性差、防治效果不好等問題,生防菌組合可以延長生防菌的作用期限,提高生防效果和穩定性[27-28]。如葛紅蓮等[29]利用生防細菌組合防治辣椒青枯病,相比單一菌株, 復合菌劑更能適應多種病原物、環境變化和多種類型的土壤。本研究亦對后期使用組合生防菌防治枸杞根腐病害有借鑒作用。