優化后的QuEChERs方法測定不同基質中百菌清農藥殘留

劉 賀,張 鵬,孫利東,彭 菲 馬 玲,劉振偉,田國輝

(1.滿洲里海關技術中心 食品實驗室,滿洲里021400;2.黑龍江大學 功能無機材料化學教育部重點實驗室,哈爾濱 150080)

0 引 言

施用農藥是農業系統中通過控制昆蟲、真菌、雜草和其他有害生物來減少作物損失、提高產量、提高作物質量所使用的主要方法之一[1]。百菌清(Chlorothalonil,CTN)是一種高效、低排的非內息性、廣譜、保護性有機氯殺菌劑[2-3],被廣泛噴灑于花卉、果蔬、糧食等作物用于病蟲害的防治。百菌清是酶活性抑制劑,通常認為其作用機理是與真菌細胞中的三磷酸甘油脫氫酶中的半胱氨酸的蛋白質相結合,使真菌細胞的新陳代謝受破壞失去生命力達到抑菌目的[4-5]。然而百菌清良好的黏著性導致其在果蔬、土壤及水體中產生較大的殘留,直接對生態環境和人體健康造成嚴重危害[6]。該農藥性質穩定,根據土壤理化性質不同,半衰期最長可達6個月之久,殘效期長,具有明顯的毒性蓄積[7]。2017年10月27日,世界衛生組織國際癌癥研究機構公布了致癌物質清單,百菌清在2B類致癌清單中[8]。2020年,歐盟正式決定實施對百菌清的禁令[9],因此,食品中百菌清殘留的檢測日益受到人們的重視。

目前,針對果蔬中百菌清殘留量檢測方法主要有高效液相色譜法[10-11]、氣相色譜法[12-14]和氣相色譜-質譜法[15-16]等技術。王天麗等用Florisil柱富集、凈化,用乙酸乙酯洗脫GC-ECD檢測環境水樣中百菌清農藥殘留[17];李旭霞用HLB固相萃取小柱,全自動固相萃取-氣質聯用法檢測地表水中百菌清農藥殘留[18];李凌云等用乙腈提取,鹽析后離心,膜過濾后使用液相色譜-串聯質譜法測定蔬菜中百菌清殘留量的方法[19]。上述百菌清的前處理檢測技術步驟繁多,提取劑消耗量大,既浪費又對環境造成二次污染,部分提取后不經凈化步驟,會增加儀器維護頻率,不符合大批量檢測的要求。

QuEChERs前處理方法是近年來國際上運用最廣泛的一種樣品前處理技術,由美國Anastassiades教授等于2003年開發,其原理是利用吸附劑填料吸附基質中的雜質從而達到凈化的目的[20]。根據樣品基質中的雜質不同,吸附劑的選擇及用量也不同。本研究設計建立了一種優化后的QuEChERs前處理方法,使用N-丙基乙二胺、C18粉末(ODS)、多壁碳納米管為吸附劑進行凈化,使用氣相色譜-電子捕獲檢測器檢測果蔬中百菌清殘留量,對比不同儀器檢測百菌清的檢出限與定量限,通過考察回收率與精密度的數值,確定該方法的實用性,以期滿足果蔬中百菌清殘留量的快速檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BS 150A電子天平(上海有聲恒器有限公司);XW-200E型漩渦混合器(上海青浦瀘西儀器廠);HC-3518型離心機(安徽中科);氮氣發生器(美國Parker公司);Milli-Q去離子水發生器(美國Millipore公司);氣相色譜儀(美國Agilent科技有限公司),電子捕獲檢測器(ECD)。

百菌清農藥標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司,純度大于99 %);正己烷、冰乙酸(分析純,上海展云化工有限公司);乙腈 (色譜純,美國TEDIA公司);丙酮(色譜純,上海化學試劑廠);硫酸鎂、乙酸鈉(分析純,天津富裕化工廠);0.22 μm微孔有機濾膜(上海安譜實驗股份科技有限公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18粉末(ODS)(天津博納艾杰爾公司);多壁碳納米管(MWCNTs)(中國科學院成都有機化學有限公司),所有用水均為去離子水。

1.2 GC-ECD儀器檢測條件

氣相色譜儀配有電子捕獲檢測器(ECD);色譜柱：HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm);載氣：氮氣(純度≥99.999%);柱流速1.0 mL·min-1;柱溫：45 ℃保持2 min,以6 ℃·min-1升溫至270 ℃,保持8 min;進樣口溫度：190 ℃;檢測器溫度：320 ℃;進樣方式：不分流進樣;進樣量：1 μL。

1.3 百菌清標準儲備液配制

稱取百菌清農藥標準品1.0 mg于100 mL容量瓶中,用正己烷稀釋,配制成1 000 mg·L-1的標準儲備液,將其放置在低溫(0～4 ℃)環境中儲存。

1.4 樣品前處理

稱取果菜樣品10.00 g于50 mL離心管中,加入10 mL 1%乙酸-乙腈混合溶液,漩渦1 min使其充分混勻,加入陶瓷均質子,加入5 g硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉,劇烈振搖后,漩渦1 min使其混合均勻,4 200 r·min-1離心分離5 min,使有機相與水相分層。移取6 mL上層清液至裝有吸附材料(硫酸鎂900 mg,PSA 150 mg,MWCNTs 15 mg)的15 mL離心管中,充分漩渦使其混合均勻,4 200 r·min-1離心分離5 min。準確吸取2 mL上清液移入15 mL濃縮瓶中,在40 ℃水浴中氮氣條件下吹至近干,以丙酮∶正己烷(1∶1)混合溶液復溶定容至1 mL,使用有機系濾膜(0.22 μm)過濾,使用GC-ECD分析測定。

1.5 基質標準曲線的繪制

準確吸取1.3中制備的百菌清標準儲備液1.00 mL(精確到0.01 mL)于10 mL容量瓶中,用正己烷定容,配制成100 mg·L-1的溶液。移取1.00 mL 100 mg·L-1標準溶液并于40 ℃水浴中氮吹至近干,使用不同的果蔬(番茄、黃瓜、芒果和奇異果)空白基質溶液將其復溶,隨后使用空白基質逐級稀釋配制成0.000 625、0.001 25、0.002 5、0.00 5、0.01和0.1 mg·L-1系列基質標準溶液,在1.2中色譜條件下進樣檢測,得到百菌清基質色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標、百菌清濃度(C)為橫坐標繪制基質標準曲線,并擬合得到線性方程及線性相關系數。基質標準溶液現配現用。

1.6 添加回收實驗

在稱量好的空白果蔬樣品(芒果)中添加一定量的標準儲備溶液,使添加水平分別為0.05、0.10和0.50 mg·kg-1,每個濃度水平重復6次,同時設立空白對照,計算回收率和相對標準偏差(Relative standard deviation,RSD)。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

根據待測物百菌清農藥在有機試劑的溶解性,對比提取溶劑分為丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液時果蔬中百菌清的回收率,結果如圖1所示。可以看出,百菌清農藥在1%乙酸-乙腈中的回收率均明顯高于在丙酮和乙腈中的回收率,在乙腈中加入少量的乙酸,使溶液變為酸性,更有利于提高百菌清的提取效率。因此,采用1%乙腈-冰乙酸溶液進行提取。

圖1 百菌清農藥在不同提取溶劑中的回收率Fig.1 Recovery rates of chlorothalonil pesticide in different extraction solvents

圖2 百菌清農藥的標準色譜圖Fig.2 Standard chromatogram of chlorothalonil pesticide

2.2 色素吸附劑的選擇及用量

在水果蔬菜檢驗中,僅使用PSA和C18時,會出現無法去除色素的問題,造成雜質峰過多,影響檢測精度,也易造成氣相色譜進樣口和色譜柱的污染。常規QuEChERs前處理方法使用的色素吸附劑通常為石墨化炭黑(Graphitized carbon black,GCB),由于GCB表面的正六元環結構,使其對平面分子有極強的親和力,在吸附果蔬的色素和甾醇等雜質的同時,會吸附很多平面結構的農藥,而百菌清恰好為平面結構。選擇了兩種色素吸附劑,三種用量,使用黃瓜基質,添加百菌清0.50 mg·kg-1,回收率結果如表1所示。實驗結果也驗證了猜測,具有平面結構的百菌清不適宜使用GCB作為色素吸附劑。而MWCNTs作為除色劑,對平面結構的農藥吸附較小,回收率比較穩定,所以選擇MWCNTs作為色素吸附劑。隨著MWCNTs用量的增加,回收率呈小幅降低,故確定MWCNTs的最佳使用量為15 mg。

表1 兩種色素吸附劑回收率實驗Table 1 Recovery rate experiments of two kinds of pigment adsorbent

2.3 線性范圍、檢出限和定量限結果分析

在農藥殘留檢測過程中,由于果蔬樣品色素、有機酸、糖類的含量較多,會出現過多雜質峰干擾檢測結果,同時易形成基質效應。為了減少雜質峰及基質效應的影響,采用基質標準曲線進行結果分析。建立百菌清基質標準曲線,進行線性回歸計算。信噪比為3時,對應樣品的質量濃度為檢出限;信噪比為10時,對應樣品的質量濃度為定量限。檢測結果如表1所示,實驗表明,百菌清在果蔬樣品中,相關系數(R)為0.99以上,線性范圍為0.0006 3～0.1 mg·L-1;檢出限為0.000 63 mg·kg-1,定量限為0.001 9 mg·kg-1。符合我國國家標準GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定的限量要求[21]。

2.4 與其他儀器檢測方法對比

將本文結果與文獻中不同儀器檢測果蔬中百菌清殘留量的定量限與檢出限對比,如表2所示。本文方法測得的最低檢出限與定量限分別為0.000 63和0.00 19 mg·kg-1,明顯低于其他儀器檢測方法,具有更低的檢出限與更高的靈敏度。

表2 不同果蔬樣品中百菌清的線性方程、相關系數、定量限和檢出限Table 2 Linear relationship,correlation coefficient,quantification limit and detection limit of chlorothalonil in different fruit and vegetable samples

2.5 回收率與RSD結果分析

對不同果蔬樣品進行添加回和相對標準偏差實驗研究。進行低、中、高三個不同濃度添加水平回收試驗,加標水平分別為0.05、0.10和0.50 mg·kg-1,每個水平做6個平行樣品測定,在不同基質中加入標準溶液后充分混勻,使百菌清與果蔬樣品充分接觸,依照1.2實驗方法進行檢測分析,檢測結果如表3所示。結果表明,百菌清樣品回收率為93%～105%,RSD為1.7%～5.8%,均符合農藥殘留分析檢測要求[24]。

表3 不同儀器檢測果蔬中百菌清的檢出限與定量限的對比Table 3 Comparison of detection limit and quantification limit of chlorothalonil in fruits and vegetables by different instruments

表4 百菌清的添加回收率、RSD及重復性(n=6)Table 4 Recovery rate,RSD and repeatability of chlorothalonil (n=6)

運用本文建立的方法對市售果蔬共307個樣品進行檢測監控,按1.4方法進行樣品前處理,按照1.2儀器條件進行測試分析,結果顯示,所有果蔬中百菌清農藥殘留均低于檢出限。

3 結 論

建立了測定常見果蔬中百菌清殘留量的QuEChERs-GC-ECD快速檢測方法。采用1%乙酸乙腈提取,15 mg多壁碳納米管作為色素吸附劑,使用GC-ECD進行檢測,具有檢測限低、操作簡單、重現性好、準確率高和結果可靠的優點,其檢測成本低,檢測時間短,滿足大批量快速檢測的要求,具有實際應用價值,同時也為果蔬中其他農藥殘留檢測提供可借鑒的方法。