艾灸對癌性疲勞小鼠AKT-NF-κB信號通路的影響

李丹　胡凱文　韓麗　趙百孝

摘要 目的：觀察艾灸對癌癥相關性疲勞（CRF）的作用及對AKT-NF-κB信號通路的影響。方法：選取BALB/C小鼠55只，隨機分為空白組（n=10）、對照組（n=15）、艾灸組（n=15）、紅外組（n=15）。空白組無任何處理，對照組選擇4T1乳腺癌細胞系皮下移植聯(lián)合順鉑構建CRF動物模型，艾灸組及紅外組分別予以艾灸、紅外照射CRF小鼠關元穴4周。干預治療后檢測小鼠行為學（疲勞跑臺實驗、懸尾實驗），并運用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素（IL）含量（IL-1β、IL-6、IL-10），免疫熒光檢測脾臟IL-6表達，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測腫瘤組織IL-6、核因子κB（NF-κB）p65信使核糖核酸（mRNA）表達，蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測腫瘤組織AKT、p-AKT、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達。結果：與空白組比較，對照組小鼠疲勞跑臺時間及距離，IL-10減少，跑臺電擊次數(shù)及懸尾時間，IL-1β、IL-6血清含量，脾臟IL-6熒光表達增加；與對照組比較，干預組小鼠跑臺時間及距離，IL-10增加，跑臺電擊次數(shù)和懸尾不動時間，IL-1β、IL-6含量及脾臟IL-6熒光表達，IL-6 mRNA、NF-κB p65mRNA、p-AKT與p-NF-κB p65減少；與紅外組比較，艾灸組小鼠懸尾不動時間、血清IL-6、p-NF-κB p65表達減少。結論：艾灸可改善CRF，其機制可能是通過下調(diào)AKT-NF-κB信號通路發(fā)揮作用，而紅外線是艾灸起效的重要因素。

關鍵詞 艾灸；紅外灸；癌性疲勞；炎癥介質(zhì)；AKT-NF-κB信號通路；荷瘤動物；順鉑

Effect of Moxibustion on AKT-NF-κB Signaling Pathway of Cancer-related Fatigue Mice

LI Dan1，HU Kaiwen2，HAN Li3，ZHAO Baixiao4

（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 3 School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102401，China; 4 Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To observe the effect of moxibustion on cancer-related fatigue（CRF） and the AKT-NF-κB signaling pathway.Methods：A total of 55 BALB/C mice were randomly divided into blank group（n=10），control group（n=15），moxibustion group（n=15） and infrared group（n=15）.The blank group received no treatment，while the control group was given subcutaneous transplantation of 4T1 breast cancer cell line combined with cisplatin to construct a CRF model.The moxibustion group and the infrared group were treated with moxibustion and infrared irradiation，respectively at Guanyuan（CV 4） of CRF mice for 4 weeks.After intervention，the behavior of mice（treadmill fatigue test and tail suspension test） was observed，and enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the serum level of interleukins（IL-1β，IL-6，and IL-10）.Immunofluorescence was used to determine the expression of IL-6 in spleen.Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） was performed to determine the mRNA expressions of IL-6 and NF-κB p65 in tumor tissues，and the protein expressions of AKT，p-AKT，NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in tumor tissues were detected by Western blot.Results：Compared with the blank group，the control group presented shortened treadmill time and distance，decreased IL-10，increased number of electric shocks，prolonged tail suspension time，and elevated serum levels of IL-1β and IL-6 and expression of IL-6 in spleen.Compared with the conditions in the control group，the treadmill time and distance and IL-10 were increased，and the number of electric shocks，tail suspension time，elevated serum levels of IL-1β and IL-6 and up-regulated expression of IL-6 in spleen; the mRNA expressions of IL-6 and NF-κB p65 as well as the expressions of p-AKT and p-NF-κB p65 in the intervention groups were decreased.The infrared group had shorter tail suspension time and lower serum levels of IL-6 and p-NFκB p65 than the moxibustion group.Conclusion：Moxibustion can improve CRF via the mechanism of down-regulating AKT-NF-κB signaling pathway，and infrared is an important factor for the efficacy of moxibustion.

Keywords Moxibustion; Infrared moxibustion; Cancer-related fatigue; Inflammatory mediator; AKT-NF-κB signaling pathway; Tumor-bearing animals; Cisplatin

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.013

隨著癌癥患者生存期的延長，癌癥相關性疲勞（Cancer-related Fatigue，CRF）逐漸受到關注。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南將CRF定義為“一種與腫瘤相關的，與體力消耗不成正比的持續(xù)存在的情緒、認知疲勞感”［1］。研究表明，接受手術的患者100%會有疲乏，接受放化療的患者發(fā)病率分別為82%～96%和75%～96%，選擇干擾素治療的患者得病率高達70%～100%［2］。現(xiàn)階段，CRF的西醫(yī)療效欠佳，傳統(tǒng)外治法開始嶄露頭角［3-5］。據(jù)報道，艾灸療法能明顯改善CRF患者的臨床癥狀及生命質(zhì)量，但其作用機制尚不明確［6-7］。現(xiàn)代醫(yī)學認為艾灸是以熱輻射為主的綜合療法［8］，紅外灸療儀能部分替代艾灸的理化作用。因此，本實驗選擇艾灸及同波長紅外照射CRF小鼠關元穴4周，檢測其疲勞狀態(tài)、炎癥介質(zhì)及AKT-NF-κB信號通路上的相關指標，以期闡釋艾灸對CRF的防治作用及機制內(nèi)容，豐富其學術內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 選取無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級雌性BALB/C小鼠55只，鼠齡7周，體質(zhì)量15～25 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0006。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室，室溫20～25 ℃，相對濕度60%～80%，保持通風，定時換氣，每日光照12 h。4T1乳腺癌細胞，來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，5% CO2、37 ℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，2～3 d換液傳代。本實驗通過北京中醫(yī)藥大學倫理委員會審批（倫理審批號：BUCM-2021031104-1071）。

1.1.2 藥材 艾條（16 mm×130 mm）：北京國醫(yī)研醫(yī)藥技術開發(fā)有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 蛋白激酶B（AKT）抗體（CST公司，美國，批號：4685），p-AKT抗體（CST公司，美國，批號：4060），核因子κB p65抗體（CST公司，美國，批號：8242），p-核因子κB p65抗體（CST公司，美國，批號：3033），Actin抗體（Abcam公司，英國，批號：ab6276），CRH抗體（Proteintech，批號：10944-1-AP），白細胞介素（Interleukin，IL）-6抗體（Abcam，批號：ab9324），羊抗兔IgG（Abcam公司，英國，批號：ab6721），羊抗鼠IgG（Abcam公司，英國，批號：ab6789）；超凈工作臺（哈爾濱市東聯(lián)，型號：FLC-3），離心機（艾本德，德國，型號：5415D），雙垂直電泳槽（北京凱元信瑞儀器有限公司，型號：MP-8001），電泳儀（北京凱元信瑞儀器有限公司，型號：PP-1150），分光光度計（賽默飛世爾科技，美國，型號：NANODROP 2000），熒光定量PCR儀（北京凱元信瑞儀器有限公司，型號：9600Plus），溫控搖床（中國其林貝爾公司，型號：TS-2000A），渦旋振蕩儀（中國其林貝爾公司，型號：QL-902），紅外陶瓷/石墨烯智能灸療儀（北京德源博匯，型號：BXM-02），小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀（北京微信斯達公司，型號：YLS-10B）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將55只BALB/C小鼠適應性飼養(yǎng)后，隨機將其分為空白組（n=10）、對照組（n=15）、艾灸組（n=15）和紅外組（n=15）。除空白組外，參照歐陽明子等［9］的方法，選擇1×107個/mL 4T1乳腺癌細胞懸液于小鼠左腋下種植0.1 mL，1周后等到腫瘤大小達到50～100 mm3后，向小鼠腹腔注射順鉑5 mg/kg/次，復制CRF小鼠模型。

1.2.2 干預方法 根據(jù)預實驗結果，并按人與動物等效劑量換算法，分別算得艾灸干預劑量、時間及頻率，即艾灸組在對照組基礎上艾灸關元穴，每次干預20 min，1次/d，6次/周，干預4周。紅外組在小鼠關元穴距離5 cm處垂直發(fā)射紅外光源，輸出功率8 W，紅外波長3.9 μm，輻照面積12.5 cm2進行干預治療，每次干預20 min，1次/d，6次/周，干預4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 行為學檢測 1）疲勞跑臺實驗［10］：干預4周后24 h采用YLS-10B小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀研究各組小鼠間疲勞狀態(tài)，記錄小鼠每次實驗的奔跑時間、奔跑距離及電擊次數(shù)。2）懸尾實驗［11］：干預4周后24 h將小鼠尾部后1/3處用膠帶懸掛于支架上，頭部距離臺面15 cm，計時6 min，觀察小鼠后4 min（第3～6分鐘）的不動時間進行統(tǒng)計。

1.2.3.2 動物取材 各組小鼠行為學檢測后立即取材。用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，摘除小鼠眼球取血，暴露心臟，置于干凈的EP管中，室溫靜置2 h，離心半徑13.5 cm，2 500 r/min，離心15 min，取血清置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ?.9%氯化鈉溶液和預冷的4%多聚甲醛灌注小鼠后取出脾臟、腫瘤組織用于固定24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋切片（厚度為3 μm）的制作及組織蛋白的檢測。

1.2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測免疫細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 按照試劑盒說明書操作，分別設置不同濃度標準品孔、空白孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標記的抗體，37 ℃溫育60 min，棄去液體，重復洗版5次，加入底物，37 ℃避光孵育15 min，各孔加入終止液，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的吸光度，通過標準品直線回歸計算出濃度相對值。

1.2.3.4 組織免疫熒光檢測脾組織IL-6蛋白表達依次將組織切片進行石蠟切片脫蠟至水后，將切片置于盛滿pH值8.0的EDTA抗原修復緩沖液修復盒中修復抗原，溫度達到95 ℃后計時30 min，切勿干片。冷卻后將玻片置于磷酸鹽緩沖液（Phosphate-Buffered Saline，PBS）（pH值7.4）中晃動洗滌3次，5 min/次。于濕盒內(nèi)用5% BSA封閉30 min。抗體染色，4 ℃過夜。用0.01M PBST漂洗5 min×3次（震蕩漂洗）。加熒光標記的二抗（羊抗小鼠IgG/Cy3 1∶200，羊抗兔IgG/FITC 1∶200），37 ℃濕盒避光作用30 min。用0.01 mol/L PBST避光漂洗5 min×3次。甘油緩沖液封片于全景掃描儀中觀察并采集圖像。

1.2.3.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）法檢測IL-6及核因子κB p65 mRNA表達 按總RNA提取試劑盒提取腫瘤組織樣本中總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA的完整性。按mRNA cDNA綜合試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镌O計由北京基譜生物科技有限公司完成，按mRNA/lncRNA qPCR試劑盒說明進行擴增，擴增條件為95 ℃ 30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）×45個循環(huán)，并進行溶解曲線分析，循環(huán)完畢后將產(chǎn)物電泳或凍存，用BIOER LineGene 9600 Plus型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。所有樣本均設6個重復。見表1。

1.2.3.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測腫瘤組織AKT、p-AKT、核因子κB p65、p-核因子κB p65蛋白表達 按蛋白提取試劑盒說明書進行蛋白提取，依照電泳上樣量用SDS-PAGE Loading Buffer（5×）調(diào)整蛋白濃度，100 ℃煮沸變性10 min備用。配制12%的分離膠，5%濃縮膠。蛋白樣品上樣50 μg，濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。2 h恒流300 mA轉(zhuǎn)膜至0.22 μm孔徑PVDF膜，5% BSA室溫封閉1 h。將聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜封閉后于雜交袋中，加入用1% BSA/5% milk稀釋一抗（β-actin 1∶3 000，AKT 1∶1 000，p-AKT 1∶500，核因子κB p65 1∶1 000，p-核因子κB p65 1∶500）4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次后，加入相應二抗（羊抗小鼠IgG 1∶5 000，羊抗兔IgG 1∶5 000），室溫孵育50 min。TBST洗膜后，將PVDF膜浸泡于ECL顯色液中1 min，暗室中曝光、顯影并定影。條帶灰度值采用Image J v1.8.0統(tǒng)計軟件進行讀取，除以內(nèi)參Actin灰度值，即目標蛋白的相對表達量，所有樣本均設6個重復。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件及ImageJ軟件對實驗數(shù)據(jù)及圖像進行采集和處理。實驗數(shù)據(jù)為計量資料且呈正態(tài)分布，采用均數(shù)±標準差（±s）表示，進一步進行方差齊性檢驗，方差齊性采用單因素方差分析，繼以最小顯著性差異法（LSD）進行組間比較，不符合方差齊性的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CRF小鼠行為學結果 CRF小鼠干預4周后通過檢測疲勞跑臺實驗和懸尾實驗驗證機體和精神兩方面疲勞。與空白組比較，對照組小鼠跑臺時間、距離均顯著降低（均P<0.01），電擊次數(shù)和懸尾不動時間顯著增加（均P<0.01），證明癌性疲勞小鼠模型復制成功。與對照組比較，紅外組、艾灸組均增加了CRF小鼠的跑臺時間、距離（均P<0.05），降低小鼠跑臺的電擊次數(shù)和懸尾不動時間（均P<0.05）。與紅外組比較，艾灸組CRF小鼠的跑臺疲勞時間、距離有增加趨勢，電擊次數(shù)減少（均P>0.05），懸尾不動時間減少（P<0.05），說明艾灸能緩解CRF小鼠的疲勞狀態(tài)。見表2～3。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測免疫細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量 對照組小鼠的IL-1β、IL-6較空白組上升，IL-10較其下降，組間差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）；干預組可減少CRF小鼠的IL-6含量，上升IL-10血清濃度，組間差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）；艾灸組與紅外組比較，IL-6顯著降低，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.3 各組蛋白的表達 對照組較空白組小鼠脾臟IL-6熒光亮度更高，形成以核膜為邊界的紅色亮斑，艾灸組和紅外組小鼠脾臟IL-6熒光較對照組減弱。對照組小鼠脾臟IL-6熒光較對照組增加，艾灸組和紅外組小鼠胞核熒光強度較對照組減少，組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見圖2～3。

2.4 各組IL-6、核因子κB p65 mRNA表達 CRF小鼠經(jīng)艾灸及紅外照射干預后小鼠腫瘤組織中的IL-6、核因子κB p65mRNA表達減少，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與紅外組比較，艾灸組小鼠瘤體組織的IL-6mRNA降低，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明艾灸及紅外照射治療能下調(diào)CRF小鼠的IL-6、核因子κB p65 mRNA的表達，激活NF-κB信號通路。見圖4。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組AKT、p-AKT、核因子κB p65、p-核因子κB p65蛋白的表達 艾灸組小鼠腫瘤組織p-AKT與p-NFκB p65蛋白表達較對照組降低，分別降低25%與47%，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；紅外組小鼠腫瘤組織p-AKT與p-核因子κB p65表達較對照組降低，分別降低23%與26%，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與紅外組比較，艾灸組p-核因子κB p65表達降低，分別減少28.41%，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖5。

3 討論

CRF屬中醫(yī)“虛證”“虛勞”范疇，臨床中常見體倦嗜臥、氣短乏力、畏寒肢冷等陽虛癥狀。《針灸問對》曰：“虛者灸之，使火氣以助元氣也。”《本草從新》又言：“艾葉苦辛，生溫，熟熱，純陽之性，能回垂絕之陽，通十二經(jīng)，走三陰，理氣血，逐寒濕，暖子宮，……以之灸火，能透諸經(jīng)而除百病。”灸法具有溫陽益氣，活血通絡等功效，可以治療虛寒諸癥，CRF屬于灸法治療范疇。

CRF是乳腺癌患者最常見癥狀。研究表明，25%～99%乳腺癌患者長期處于疲乏狀態(tài)，嚴重影響了患者的生命質(zhì)量及生存時間［12］。因此，本研究從乳腺癌性疲勞動物模型入手，通過行為學檢測佐證CRF模型是否成功。結果顯示，各組疲勞度由高到低依次為：對照組、紅外組、艾灸組、空白組，各組差異有統(tǒng)計學意義。提示4T1乳腺癌細胞皮下移植聯(lián)合順鉑腹腔注射的方法成功復制了CRF模型，艾灸及紅外照射治療能緩解CRF，結果與國內(nèi)外報道一致［13-15］。與紅外組比較，艾灸組能減少懸尾小鼠不動的時間，說明艾灸緩解精神疲勞的作用更佳，可能與其藥理作用有關。

目前CRF的發(fā)病機制尚不明確［16-18］。炎癥反應假說認為長期存在的炎癥反應環(huán)境，特別是如IL-1、IL-6、IL-10等細胞因子可誘導機體發(fā)熱，在CRF中發(fā)揮關鍵作用［19-20］。NF-κB信號通路是胞內(nèi)重要的控炎通道，激活的核因子κB能促進IL-1β、IL-2、IL-6等的轉(zhuǎn)錄及釋放，進而反向刺激IL-10的表達，阻止胞內(nèi)核因子κB活化，誘導抗炎反應。研究表明，磷酸化的AKT可激活NF-κB信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應［21］。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可通過降低核因子κB表達逆轉(zhuǎn)炎癥反應狀態(tài)達到治療目的［22-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組CRF小鼠的IL-1β、IL-6、AKT、核因子κB p65含量及IL-6、核因子κB p65 mRNA水平明顯升高，IL-10含量下降，經(jīng)艾灸及紅外照射治療后，對照組模型鼠的炎癥反應狀態(tài)顯著改善，提示艾灸及紅外照射或許通過抑制AKT-NF-κB通路介導的炎癥反應狀態(tài)發(fā)揮作用。

此外，本研究結果示，與紅外組比較，艾灸組明顯降低了血清中IL-6、核因子κB p65及IL-6、核因子κB p65 mRNA的含量，脾臟IL-6免疫熒光陽性表達有升高的趨勢，說明艾灸組對NF-κB信號通路的作用優(yōu)于紅外組，同一波長的紅外線較好模擬了艾灸的光熱效應，是艾灸起效的關鍵因素之一，但不能完全替代艾灸的綜合作用，而艾灸改善CRF的其他作用因素尚需要進一步研究證實。

綜上所述，磷酸化的AKT能促進核因子κB分子的激活，促進NF-κB信號通路介導的炎癥反應，在CRF的發(fā)生進展中發(fā)揮重要作用。本研究結果表明，艾灸可不程度降低荷瘤及順鉑導致的CRF，其機制可能是通過調(diào)節(jié)AKT-NF-κB信號通路。

利益沖突聲明：無。

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（2022-01-24收稿 本文編輯：吳珊）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFC1711904）作者簡介：李丹（1991.08—），女，博士研究生在讀，研究方向：中西醫(yī)結合防治惡性腫瘤，E-mail：20190941214@bucm.edu.cn通信作者：趙百孝（1963.03—），男，博士，教授，研究方向：艾灸的作用機制，E-mail：baixiao100@vip.sina.com