紫梗籽銀桂種胚發育與胚乳營養物質的變化研究

朱永莉, 沈永寶

(1.南京林業大學風景園林學院, 南京 210037; 2.上海商學院藝術設計學院, 上海 201400;3.南京林業大學林學院, 南京 210037; 4.國家林業和草原局南方林木種子檢驗中心, 南京 210037;5.南京林業大學,南方現代林業協同創新中心, 南京 210037)

高等植物種子發育通?？煞譃樾螒B發育階段(胚、胚乳和種皮發育)和種子成熟階段(胚根的生長和種子灌漿),其中后者是種子發育的重要階段,碳水化合物、脂質和蛋白質等貯藏物質的動態變化對種子的質量具有重要的意義[1-3]。植物種子發育過程需要可溶性糖、淀粉、蛋白質等營養物質以保證種子與胚的正常發育[4-9],因此研究種胚發育過程中內含物質的變化規律有利于了解種子的成熟過程和發育機理。桂花(Osmanthusfragrans)為木犀科木犀屬常綠木本植物,是我國傳統十大名花之一,桂花樹姿優美,香味濃郁,具有很高的園林觀賞價值,現廣泛栽培于北亞熱帶和中亞熱帶地區[10]。近年來,有關桂花資源分布[11]、品種分類[10,12]、開花及傳粉生物學[13-14]、胚胎學[15-16]、保護遺傳學[17-18]、繁殖生物學[19-20]及種子休眠[21-22]等方面的研究較多,而與桂花種子的發育生物學相關的研究略顯薄弱。另外,桂花秋季(9—10月)開花,次年4—5月種子成熟,種子發育時間長,且結實率低導致取材難度較大,限制了桂花種子的發育生物學研究。為深入了解桂花種胚發育過程及成熟機制,本研究以發育不同時期的紫梗籽銀桂種子為研究對象,觀察種胚形態發育過程,分析發育過程中可溶性糖、淀粉、蛋白質和粗脂肪等營養物質含量變化,揭示其種子發育過程中生理特性和重要指標的變化規律,探討桂花種胚發育成熟的機制,為探明桂花種胚發育生理過程及其分子作用機理奠定基礎,以期為桂花實生苗木培育、種質資源保存提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料為紫梗籽銀桂(O.fragrans‘Zigengziyin’),試驗所用的種子采于南京市八卦洲街道院內,于花后60 d開始,至來年果實成熟,每隔15～20 d進行取樣,共取樣11次。紫梗籽銀桂花期9—10月,果實成熟次年4—5月,花后180 d,種胚開始大量形成。采集的材料用冰盒帶回實驗室后立即去除果皮取出種子,一部分用于測定種子大小、含水量等變化,觀察種胚形態建成,另一部分分別剝離胚和胚乳,放入-76 ℃超低溫冰箱保存用于可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、粗脂肪等組分測定。

1.2 研究方法

1.2.1種實生物學特性研究

隨機選取30粒不同發育階段的果實,用體式顯微鏡觀察各個時期的種子及種胚的發育狀況;用游標卡尺測量果實的縱徑和橫徑,精確到0.001 cm。隨機取5 g左右果實,用美國LI-COR公司生產的LI-6400光合儀測定果實的呼吸強度,依據GB 2772—1999《林木種子檢驗規程》,采用烘箱恒溫干燥法測定果實含水量。

1.2.2胚乳營養物質的測定

可溶性糖含量[23]、淀粉含量[24]測定采用蒽酮比色法,可溶性蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍G-250法[23],粗脂肪含量測定采用索氏提取法[23]。

1.3 數據分析

運用 Excel 2013軟件對數據進行分析處理和圖表制作,采用SPSS 20.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 種實生物學特性

2.1.1果實形態變化

紫梗籽銀桂果實由外至內依次為外果皮、中果皮(果肉)和內果皮(種殼)及種子。從花后60 d到花后120 d,外果皮和中果皮(果肉)部分均為綠色,種實含水量較高,胚乳呈膠狀液體,內果皮的木質化程度逐漸加深(圖1 a～圖1 d)?；ê?35 d,胚乳逐漸變濃稠,邊緣部分出現白色固體狀物質(圖1 e);花后150 d,種胚開始形成(圖1 f);至花后165 d,胚體開始出現,胚乳成為白色固體狀態(圖1 g);花后180 d開始,種胚大量形成(圖1 h～圖1 i);花后195 d,果皮變為紫色,果肉變軟,易于剝離,種殼進一步木質化,變厚變硬,胚乳變為白色固體狀態,胚逐漸占滿胚腔,種子發育趨于成熟,此后紫梗籽銀桂的種實在形態上未有太大變化(圖1 j);花后210～225 d,果實進一步發育成熟,果皮變為紫黑色,胚完成形態后熟占滿整個胚腔,子葉、胚軸、胚根清晰可見,種殼靠近胚根處發芽孔開裂,種子發育成熟(圖1 k～圖1 l)。

注:a～l為紫梗籽銀桂果實不同時期縱剖面(20×)。

2.1.2果實大小變化

紫梗籽銀桂果實的大小在發育過程中基本呈持續上升的趨勢,縱徑從花后60 d的0.652 cm到花后225 d(果實成熟)時增加到1.581 cm,橫徑從0.249 cm增加到0.707 cm,分別增長了0.929 cm和0.458 cm(圖2)。

圖2 紫梗籽銀桂發育過程中果實大小變化

2.1.3胚的變化

紫梗籽銀桂種子發育過程中種胚的比率和種胚長度變化如圖3、圖4所示,其胚的發育大約經歷三個階段:花后150～165 d為種胚開始形成期,胚體可見,種胚的平均長度約為0.137 cm;花后165～195 d為種胚快速形成期,該階段胚的長度升至0.628 cm,胚形成率由花后180 d的15%上升至花后195 d的53%;花后195～225 d為種胚成熟期:該階段胚的長度上升至0.928 cm,種胚形成率也上升至93%。

圖3 紫梗籽銀桂種子發育過程中種胚形成的比率變化

圖4 紫梗籽銀桂種子發育過程中種胚的長度變化

2.1.4果實呼吸速率變化

如圖5所示,紫梗籽銀桂果實發育過程中呼吸速率整體呈下降趨勢?；ê?0 d到花后80 d, 呼吸速率從47.556 μmol/(g·min)下降到33.582 μmol/(g·min),這期間果實中含水量增長較快,種殼內主要呈液體狀膠狀物,呼吸速率下降;花后80～120 d,呼吸速率從33.582 μmol/(g·min)上升到44.319 μmol/(g·min),果實呼吸速率上升并趨于穩定,花后120 d后再下降,直到花后180 d呼吸速率下降至29.403 μmol/(g·min),花后195 d下降到15.584 μmol/(g·min),這可能是由于花后80～120 d果實的發育較旺盛,細胞分裂活躍,需要較多的物質和能量,呼吸作用較強;從花后120 d之后隨著果實的發育,各項組織逐漸成熟,呼吸速率逐漸降低,花后180 d種胚大量形成,種殼(內果皮)趨于木質化,種子發育趨于成熟,呼吸速率急劇下降;花后195～225 d,隨著果實和種子的發育,胚進一步長大完成形態后熟占滿胚腔,外果皮和中果皮隨著種子和果實的發育成熟逐漸軟化解體,呼吸作用有所增強,呼吸速率上升,從15.584 μmol/(g·min)上升到19.833 μmol/(g·min),基本趨于穩定。這與之前的細胞學解剖結構觀察基本一致。

圖5 紫梗籽銀桂果實發育過程中呼吸速率和含水量變化

2.1.5果實含水量變化

紫梗籽銀桂果實發育過程中含水量呈先升后降趨勢。花后60～165 d,隨著果實由小到大發育,果實的含水量呈上升趨勢,由71.10%上升到82.49%,此階段果實中各種組織尚未發育成熟,果實中含水量較高。隨著果實的發育,胚乳內營養物質不斷積累,胚不斷成熟,果實含水量逐漸下降,至花后225 d果實發育成熟,含水量為72.75%,后趨于穩定(圖5)。

2.2 胚乳營養物質的變化

2.2.1可溶性糖含量變化

隨著紫梗籽銀桂種子的發育,胚乳內可溶性糖含量總體呈上升的趨勢?；ê?0 d胚乳中可溶性糖含量0.52%,花后150 d上升到0.79%,之后出現略微下降,花后165 d,可溶性糖含量下降至0.63%,這可能是由于這一階段胚開始形成,胚的發育消耗一定的糖,導致可溶性糖含量下降;花后180～195 d,隨著種子的進一步發育,胚乳由膠狀液態變為白色固態,胚乳中營養物質積累加速,可溶性糖含量上升幅度較大,由0.64%上升至1.04%,之后可溶性糖含量繼續上升,至花后225 d上升至1.26%,種子發育成熟,為種子萌發儲備物質和能量(圖6)。

圖6 紫梗籽銀桂種子發育過程中可溶性糖含量變化

2.2.2淀粉含量變化

紫梗籽銀桂種子在發育過程中淀粉含量呈先降后升的趨勢?；ê?0～100 d,淀粉含量由21.6%上升至24.39%,之后逐漸下降,至花后150 d,下降至16.03%,這可能是在種子發育的前期,胚乳內淀粉逐漸被水解為可溶性糖供種子利用,這與該段時期內可溶性糖含量的變化相吻合;花后150 d開始,隨著種胚的出現,淀粉含量逐漸上升,花后180～195 d上升幅度較大,由19.99%上升至40.3%,此時胚發育進一步成熟,逐漸占滿胚腔,胚乳由膠狀液態變為白色固態,胚乳中營養物質積累加速,淀粉含量升高,之后隨著種子的發育成熟,淀粉含量上升至46.78%(花后210 d),之后略為下降,后趨于穩定(圖7)。

圖7 紫梗籽銀桂種子發育過程中淀粉含量變化

圖8 紫梗籽銀桂種子發育過程中可溶性蛋白含量變化

2.2.3可溶性蛋白含量變化

紫梗籽銀桂種子發育過程中可溶性蛋白含量前期變化比較平穩,后期呈上升趨勢?；ê?0～165 d,可溶性蛋白含量較平穩,花后165 d開始逐漸上升,花后180～195 d可溶性蛋白含量的上升幅度較大,從8.15 mg/g升至24.51 mg/g,該段時期胚逐漸占滿胚腔,胚乳由膠狀液態變為白色固態,胚乳中營養物質積累加速,至花后210 d可溶性蛋白含量有所下降,可能是種胚發育進入后期,需要較多的蛋白質支持,到花后225 d種子成熟,可溶性蛋白含量有所恢復保持穩定,為種子萌發做好準備(圖8)。

2.2.4粗脂肪含量變化

紫梗籽銀桂種子發育過程中粗脂肪含量不斷增加。花后80～165 d,增加比較緩慢,由8.83%增加至10.68%,花后180 d之后,上升幅度較快,粗脂肪含量由11.17%上升到18.67%,作為胚乳中的營養物質大量儲存,為種子萌發做好準備(圖9)。

圖9 紫梗籽銀桂種子發育過程中粗脂肪含量變化

3 討 論

種子的成熟過程實質上就是胚從小長大,以及營養物質在種子中變化和積累的過程[25],包括化合物的積累、酶類及激素的調節與代謝等[26]。紫梗籽銀桂種胚的發育大約經歷三個階段:種胚開始形成期、種胚快速形成期和種胚成熟期。種子各類營養物質快速積累發生在花后180 d之后,此期間種胚開始大量形成,到種子成熟階段達到峰值。紫梗籽銀桂果實在發育初期含水量較高,隨著果實的發育成熟,胚乳內營養物質不斷積累,果實含水量逐漸下降并趨于穩定,在此期間原生質也由溶膠狀態轉變為凝膠狀態,種子的生命活動亦由代謝活躍轉入休眠狀態[27]。紫梗籽銀桂果實在花后前165 d,果實的含水量呈現上升趨勢。在花后165 d之后,胚開始出現,胚乳內營養物質不斷積累,果實含水量逐漸下降,至果實成熟基本趨于穩定。這與紫花地丁Viola philippica[28]、牡丹Paeonia × suffruticosa[29]、黃蓮木Pistacia chinensis[30]、無患子Sapindus Saponaria[31]等物種相一致。

可溶性糖、油脂和蛋白等可為種胚的生長發育提供必須的營養和能量,并在后期作為營養物質積累起來,為種子萌發提供能量[32]。紫梗籽銀桂在花后前135 d為種子胚乳固態化的重要時期,胚乳逐漸變得濃稠,表明種子內的可溶性糖和淀粉等營養物質主要用于自身形態建成,可溶性糖、淀粉和脂肪積累較慢;在花后165～195 d,種子內部結構逐步構建完成,胚乳轉化為白色固體狀態,胚體逐步占滿胚腔,種子發育趨于成熟,在此期間,可溶性糖、油脂和蛋白上升趨勢明顯,可溶性糖、淀粉和脂肪的迅速積累可為胚胎的正常發育提供必要的能量支持。

可溶性糖作為生命活動能量的源泉,不僅是植物胚生長發育營養物質和能量的重要來源[5],而且參與種子發育后期營養物質儲存積累[32-33]。紫梗籽銀桂種子在發育過程中,胚乳可溶性糖含量總體呈現上升的趨勢(在胚建成初期略有回落),至果實成熟時達到最大(1.26%),高含量的可溶性糖為種子萌發提供物質和能量儲備。紫梗籽銀桂種胚形成過程中,在花后165 d胚形成后,可溶性糖含量迅速積累,這可能是該時期細胞處于旺盛的分裂和分化階段,可溶性糖的快速積累可滿足發育早期較高的能量支持。

紫梗籽銀桂胚乳中淀粉含量在種子發育前期呈逐漸遞增的變化趨勢,在胚建成期(花后135～165 d)略有下降,此后又逐漸上升并趨于穩定,這可能是由于在種子發育的前期,胚乳內淀粉逐漸被水解為可溶性糖供種子利用,這與該段時期內可溶性糖含量的變化相吻合?？傮w上看,紫梗籽銀桂種子的發育表現為淀粉沉積的過程,這與米槁Cinnamomum migao[34]、“鳳丹”Paeonia ostii ‘Feng Dan’[9]等種子的發育結果基本相似。

蛋白質作為種子發育過程中氮源的重要來源之一,可為種子及胚胎發育奠定物質基礎。紫梗籽銀桂種子發育過程中可溶性蛋白含量前期變化比較平穩,后期呈現上升趨勢,這與紅松Pinus koraiensis[8]、短絲木犀Osmanthus serrulatu[35]、板栗Castanea mollissima[36]等種子發育過程中蛋白質含量變化趨勢一致。由此可見,在紫梗籽銀桂種胚后期的成熟過程中,需要有大量的蛋白質參與,為種胚的繼續生長發育提供養分,并且蛋白質也作為種胚形態建成的結構組成物質發揮作用。

植物油脂的積累時期因物種的不同而存在差異[37],紫梗籽銀桂在花后前150 d胚乳沒有固化,脂肪含量增加緩慢,含量較低;在花后165 d之后,胚乳逐漸固化,脂肪含量逐漸增加,這一結果與文冠果Xanthoceras sorbifolium[38]、核桃Juglans regia[41]等物種的種子發育研究結果相似。有研究結果表明,可溶性糖會在油脂快速積累之前大量積累,但在油脂積累過程中卻不斷減少[39-42],即種子在發育過程中可溶性糖、蛋白等在積累的同時會被消耗,但本研究結果表明,紫梗籽銀桂種子脂肪含量與可溶性糖、可溶性蛋白及淀粉含量的變化趨勢基本相似,這可能與這些物種的生物學特性和取樣策略相關。