利用InDel標記劃分玉米自交系的雜種優勢群

黃艷艷, 許理文, 王鳳格, 康定明, 陳全家

(1.新疆農業大學農學院, 烏魯木齊 830052;2.北京市農林科學院玉米研究中心,玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室, 北京 100097)

玉米雜種優勢類群劃分和雜種優勢模式構建是玉米自交系選育和雜交組合組配的重要依據,對提高玉米育種效率具有重要意義。雜種優勢劃分通常用形態標記、細胞學標記、配合力表現[1]以及系譜分析等方法[2],但在人工的干擾下,以及遺傳漂移的作用和系譜資料的丟失等原因,這些方法在進行遺傳變異分析時有一定的局限性[3]。近年來,分子標記技術發展迅速,為自交系雜交優勢群的劃分提供了一定的分子學依據,劃分結果更加準確。國內外學者利用SNP[4]、SSR[5]、InDel等分子標記分別對親緣關系明確的玉米材料進行雜種優勢群劃分,所得結果與系譜資料基本吻合[6-9]。

插入/缺失(Insertion-Deletion,InDel)是指基因組中一個或多個核苷酸的插入或缺失所產生的長度多態性。其具有以下特點: 1) 分布廣泛[10-11]; 2) 穩定性強(復發性突變發生的幾率較小)[12]; 3) 地理上分離的群體間等位基因頻率存在顯著差異,有可能作為祖先信息標記[13-14]; 4) 小的InDel可以在短的擴增子中進行分析(InDel序列長度小于10 bp),且能對高度降解的DNA樣品進行準確分型。InDel標記作為最近幾年新興的分子標記,被廣泛應用于玉米種質遺傳多樣性研究。林峰等[15]利用135對InDel分布在玉米10條染色體上的分子標記引物,系統分析了491份玉米自交系的遺傳多樣性,為組配優良玉米雜交種提供了遺傳信息。

本研究利用北京市農林科學院玉米研究中心構建的多重擴增靶向捕獲測序基因分型InDel標記組合(包含1 618個InDel標記),對102份玉米自交系進行InDel標記的基因分型,旨在對新選、引育的優良自交系進行雜種優勢群劃分,為種質改良、擴增和創新及雜交組合的親本選配提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實驗收集的玉米材料屬于中國玉米育種中應用的新種質,并且具有較為廣泛的代表性和時效性,玉米材料共有102份,其中有X 178、鄭58、Mo 17、昌7-2、B 73、丹340等標準測驗種(表1)。

表1 供試玉米自交系名稱

圖1 1 618個(a)和1 011個(b)InDel標記的基因分型

1.2 儀器及耗材

光照培養箱、離心管(2 mL、1.5 mL)、鋼珠、剪刀、液氮罐、組織研磨器、離心機、恒溫水浴鍋、燒杯、量筒、微波爐、離心管架、移液器(2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、300 μL、1 000 μL)、醫用毛細管、一次性手套、衛生紙、Qubit?4.0熒光計、-20 ℃冰柜、4 ℃冰箱、振蕩器、96孔PCR儀、qPCR儀、Ion Chef儀器、Ion Gene Studio S 5 prime測序儀。

1.3 方 法

1.3.1DNA的提取和質檢

采用CTAB法提取102個樣品的基因組DNA,用Qubit?4.0熒光計進行DNA質量檢測和濃度測定。

1.3.2DNA工作液制備

使用Qubit?4.0熒光計(Thermo Fisher Scientific Company Carlsbad,USA)對上述DNA進行定量,每個樣品使用10 ng的DNA。將待測樣品的DNA溶液稀釋到2.5 ng/μL,作為基因組DNA工作液待用。

1.3.3擴增體系和程序

多重擴增靶向捕獲體系為20 μL,4 μL 5× Ion AmpliSeq HiFi Master Mix,10 μL 2× 1 011 InDel標記多重擴增預混引物,4 μL DNA工作液和2 μL無核酸酶水。

多重擴增程序如下:99 ℃ 2 min,99 ℃ 15 s的17個循環,60 ℃ 4 min,然后保持10 ℃不超過2 h。

1.3.4引物部分消化

多重擴增結束后用2 μL FuPa試劑對多重擴增靶向捕獲產物進行部分消化引物,在SimpliAmpTM熱循環儀上進行,程序如下:50 ℃ 10 min,55 ℃ 10 min,60 ℃ 20 min,最后10 ℃下保溫不超過1 h。

1.3.5測序接頭和Barcode的連接

加入Ion P 1 Adapter(測序接頭)和Ion XpressTMBarcode(文庫條形碼),并加入DNA Ligase(DNA連接酶),連接反應也在SimpliAmpTM熱循環儀上進行,程序如下:在22 ℃ 30 min,68 ℃ 5 min,72 ℃ 5 min,10 ℃下保溫不超過2 h。

1.3.6文庫的純化和測序

利用Ion Library TaqMan定量試劑盒,在QuantStudio 6 Flex實時PCR系統上對構建的待測樣品的多重擴增靶向捕獲測序文庫進行準確定量,再將文庫統一稀釋到100 pmol/L,然后取等量混合,取25 μL混合后的文庫,利用Ion 540 KIT試劑套裝在Ion Chef儀器進行自動化模板制備。

1.3.7類群分析

用PowerMarker 3.0軟件計算系之間的遺傳距離和遺傳相似度,計算出的遺傳距離用MEGA 7的UPGMA法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 基因分型分析

在本實驗中,利用多重靶向測序基因分型InDel試劑盒對102份供試材料進行InDel基因分型,共計獲得7.8 G數據,大約60 M的reads,InDel標記的平均測序深度305倍,測序深度最高的達到1 500倍,個別InDel沒有測序數據,說明玉米InDel靶向測序Panel還有優化空間。如圖1(a)所示,在1 618個InDel標記中,510個InDel的基因分型成功率(Call Rate)為100%,基因分型成功率大于80%的總共有1 035個。基于InDel標記測序數據深度和基因分型成功率對玉米InDel標記靶向測序Panel進行優化,淘汰測序數據深度小于100倍和基因分型成功率低于80%的InDel標記。如圖1(b)所示,獲得一個包含1 011個InDel標記的玉米InDel標記靶向測序Panel,取名為MaizeIDP 1 K。

2.2 引物多態性

利用PowerMarker 3.0軟件對1 270個InDel引物進行統計計算,等位基因數為2 540個,平均等位基因數為2個,總的基因型個數為3 810個,平均基因型個數為3個,多態信息含量PIC值為0.228 0～0.375 0,平均值為0.364 2。當PIC≥0.5時屬于高度多態,0.25≤PIC<0.5屬于中度多態,PIC<0.25屬于低度多態[1]。InDel標記的PIC分析結果說明所選InDel標記主要是中度多態性標記(圖2)。

圖2 1 011個InDel標記組合的PIC值分布

2.3 聚類分析

利用構建的多重擴增靶向捕獲測序InDel標記組合對102個玉米自交系材料進行基因分型,獲得了1 011個InDel標記的基因分型數據。導入PowerMarker 3.0軟件計算自交系材料間的遺傳距離,將自交系材料間的遺傳距離矩陣數據導入MEGA 7,利用UPGMA法構建了102個玉米自交系材料的聚類圖。如圖3所示,根據標準測驗種所代表的中國玉米生產主要應用的雜種優勢群,在聚類分析劃分的群中包括以CML 162為代表的亞熱帶混血群,以昌7-2為代表的黃改群,以B 73為代表的瑞德群,以Mo 17為代表的蘭卡斯特群,以丹340為代表的旅大紅骨群,以X 178為代表的P群。利用1 101個InDel標記對102份自交系材料的雜種優勢群劃分結果,與現有的雜種群和已知譜系高度一致[74-75],說明利用InDel標記對玉米材料的雜種優勢群分析是正確的,效果很好。結果證明InDel標記也適合類群劃分,為InDel標記在其他作物的類群劃分研究上的應用提供了參考依據。

注:圖中分支的顏色代表了不同的雜種優勢群,黃色代表黃改群,寶藍代表亞熱帶混血群,綠色代表瑞德群,紫紅色代表蘭卡斯特群,蔚藍色代表旅大紅骨群,紅色代表P群。

3 討 論

對于InDel基因分型的方法來說,使用靶向測序比其他方法更具有高通量、省時、省事和性價比高等優點。郭子楓等[16]利用捕獲測序技術開發了一系列具有不同標記數的玉米SNP標記Panel,并驗證其效率。成本效益分析表明,其平臺不僅適合不同的應用,而且育種者負擔得起,特別是中小型公司和發展中國家。

雜種優勢群的劃分是新選、引育優良自交系的前提,種質改良和雜交組合的親本選配之前必須要進行雜種優勢的劃分。故本試驗利用多重靶向測序InDel標記組合對102個玉米自交系進行基因分型,從而對其進行雜種優勢劃分,其結果與系譜一致。