褪黑素片中兩種功效成分含量測定方法學研究

李軍波，歐陽浩栩，郭丹，李雪峰，郁曉藝

完美（廣東）日用品有限公司（中山 528451）

褪黑素是人類和哺乳動物的腦松果體分泌的神經(jīng)胺類激素之一，具有改善睡眠質(zhì)量、克服睡眠障礙的功效[1]。近年來，隨著對褪黑素研究的不斷探索，褪黑素功能的多樣性[2-3]和與其他物質(zhì)的協(xié)同作用被逐漸發(fā)現(xiàn)[4-6]，如小劑量褪黑素在維生素B6的參與下，改善睡眠的作用更佳[7-8]。維生素B6又稱吡哆醇，是一種水溶性維生素，為氨基酸、糖及脂類代謝的輔酶[9]。在市場上諸多保健品公司研發(fā)了豐富的褪黑素和維生素B6復配產(chǎn)品[10-11]。

對保健品中褪黑素和維生素B6的含量測定中，GB/T 5009.197[12]《保健食品中褪黑素含量的測定》和GB/T 5009.170[13]《保健食品中硫酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、鹽酸、煙酰胺和咖啡因的測定》只能分別檢測褪黑素和維生素B6（以吡哆醇計），但GB/T 5009.197[12]與GB/T 5009.170[13]測試范圍及方法相近，即均適用于保健食品，均用醇類試劑超聲提取，液相色譜紫外測定。現(xiàn)有已報道研究中缺乏對褪黑素片產(chǎn)品中褪黑素和維生素B6檢測的方法的全面研究，為提高檢測效率，此研究擬參考GB/T 5009.170[13]和GB/T 5009.197[12]的前處理方法，提取褪黑素和維生素B6進行試驗研究，建立可同步檢測褪黑素和維生素B6的方法，對建立的方法進行全面的方法學研究，同時參考CNAS-GL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》[14]、JJF 1135——2005《化學分析測量不確定度評定》[15]和JJF 1059.1——2012《測量不確定度評定與表示》[16]對建立的方法進行不確定度評價。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

≥99.5%褪黑素（中國計量科學研究）；100%鹽酸吡哆醇（美國Sigma-Aldrich公司）；磷酸、無水甲醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；1-癸烷磺酸鈉（上海安譜公司）。

1.2 主要儀器與設備

1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有可變波長紫外檢測器和Openlab色譜工作站；ML204和ML205電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Elma P180H超聲波清洗器（德國JULABO公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：TSK C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相：1-癸烷磺酸鈉（1.22 g→850 mL）+乙腈+磷酸=850+150+1；流動相流速：1.0 mL/min；檢測波長：褪黑素222 nm，維生素B6280 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 標準曲線繪制

精密稱取15.44 mg維生素B6（以吡哆醇計）對照品于50 mL容量瓶中，加20 mL水溶解并定容至刻度，搖勻，得254.0 μg/mL的吡哆醇對照品儲備液，備用。精密稱取12.95 mg褪黑素對照品于50 mL容量瓶中，加20 mL體積分數(shù)為70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得257.7 μg/mL的對照品儲備液，備用。分別精密吸取10 mL對照品儲備液維生素B6和10 mL對照品儲備液褪黑素，再加入甲醇+水+磷酸=100+400+0.5混合溶液，定容至25 mL，搖勻。分別取0.25，0.5，1，2，3.5和5 mL混合對照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇+水+磷酸=100+400+0.5定容至刻度線，即得系列標準溶液。按照1.3.1小節(jié)色譜條件上機測定即為對照品標準曲線。

1.3.3 樣品提取方法

取10片褪黑素片，研細，精密稱定0.5 g（精確至

0.000 1 g），置100 mL量瓶中，加入約80 mL體積分數(shù)為70%乙醇溶液超聲提取25 min，每隔5 min振搖1次，冷卻至室溫，加入體積分數(shù)為70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻。取5 mL提取液，用水定容至10 mL得稀釋液。取稀釋液過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 不確定度評定數(shù)學模型建立方法

試驗的測量模型按式（1）計算。

式中：X為試樣中褪黑素或維生素B6的含量，mg/g；c為標準測定液中褪黑素或維生素B6的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為試樣的定容體積，mL；f為折算系數(shù)，維生素B6以吡哆醇計算折算系數(shù)為0.823，褪黑素折算系數(shù)為1；m為試樣的稱樣質(zhì)量，g。

2 結果與分析

2.1 樣品制備方法優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

現(xiàn)有國標GB/T 5009.197[12]和GB/T 5009.170[13]可分別測定褪黑素和維生素B6，故此方法參考現(xiàn)有國標GB/T 5009.197[12]和GB/T 5009.170[13]，分別使用體積分數(shù)為70%乙醇和甲醇+水+磷酸=100+400+0.5提取褪黑素片中的兩種功效成分。選用體積分數(shù)為70%乙醇同步提取褪黑素片中褪黑素和維生素B6時，維生素B6色譜峰存在峰分叉的情況如圖1所示。通過調(diào)節(jié)樣品進樣量和更換不同型號色譜柱仍無法解決維生素B6色譜峰存在峰分叉的問題。當將提取液用水稀釋一倍后維生素B6的分叉峰消失，如圖1所示。為進一步驗證，維生素B6的分叉峰原因，將維生素B6的標樣用體積分數(shù)為70%和35%的乙醇分別溶解定容后上機測試，測試結果如圖2所示。

圖1 兩種上機溶液的色譜圖

圖2 兩種溶劑溶解維生素B6的上機色譜圖

圖3 空白對照與樣品色譜圖比較

由圖1和圖2可知，維生素B6的分叉峰消失，可能是維生素B6在體積分數(shù)為70%乙醇溶劑中存在溶劑效應，導致色譜峰分叉，該結論與劉麗艷等[17]的研究結論一致。故選擇體積分數(shù)為70%的乙醇提取褪黑素片中兩種功效成分，提取時間為25 min，取提取液5 mL，用水定容至10 mL后，取稀釋液過濾后上機測試（前處理方式A）。將該測試結果與使用甲醇+水+磷酸=100+400+0.5提取（前處理方式B），上機測試比對結果進行比對，篩選最佳提取溶劑，比對結果如表1所示。

表1 兩種提取方式的結果對比 單位：mg/g

由表1可知，兩種前處理方式對維生素B6的提取后含量測定相對偏差為0.4%，無明顯差異。而選用甲醇+水+磷酸=100+400+0.5提取，檢測結果較體積分數(shù)為70%乙醇提取偏低6.9%。體積分數(shù)為70%的乙醇提取褪黑素效果更佳，故選取體積分數(shù)為70%乙醇提取樣品后用水稀釋一倍后上機測試，下一步試驗按此條件開展試驗。

2.1.2 提取時間優(yōu)化

取同一批褪黑素片樣品，分別提取10，25和40 min制成供試品溶液，注入高效液相色譜儀，計算褪黑素與維生素B6含量，結果見表2。由表2可知，25 min條件下提取褪黑素和維生素B6測定含量最高，提取最充分。故選取25 min為方法驗證的最終提取時間。

表2 不同提取時間的結果對比 單位：mg/g

2.2 方法性能研究結果

2.2.1 系統(tǒng)適用性結果

用色譜數(shù)據(jù)處理軟件計算褪黑素和維生素B6色譜峰的系統(tǒng)適用性。褪黑素和維生素B6的分離塔板數(shù)分別為7 326和13 231均大于5 000，分離度為4.32大于1.5，表明此方法的系統(tǒng)適用性良好。

2.2.2 專屬性考察結果

方法專屬性對照色譜圖如3所示。空白對照溶液色譜圖中未見與供試品溶液、對照品溶液色譜圖中褪黑素和維生素B6相同保留時間的色譜峰，證明陰性無干擾。

2.2.3 線性范圍與定量限結果

按照1.3.1小節(jié)條件進行測試，確定各成分的線性范圍（如表3所示）。由表3可知，所得褪黑素片中兩種成分的標準曲線相關系數(shù)滿足R＞0.999，兩種成分在各自范圍內(nèi)均線性良好。各成分的線性范圍均為：褪黑素2.54～50.81 μg/mL，維生素B62.55～50.06 μg/mL，按rSN=10確定各成分的定量限，褪黑素0.05 μg/mL，維生素B60.05 μg/mL。

表3 2種成分的標準曲線、線性范圍及定量限情況

2.2.4 準確度結果

通過對樣品的加標回收試驗考察此方法的準確度，取適量微晶纖維素粉末，加入適量的混合對照品，混合均勻制備成片劑。取20片制備好的加標樣品，按照最優(yōu)提取，重復制備7份樣品，參考最優(yōu)的色譜條件進樣分析，計算各對照品的加標回收率。各對照品的加標回收率在95%～105%直徑，滿足GB/T 27417——2017[18]《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》的要求，表明該方法的準確度高，檢測結果準確。具體數(shù)據(jù)詳見表4。

表4 加標回收試驗結果

2.2.5 精密度結果

通過對同一批次樣品，按照最優(yōu)提取，重復制備10份樣品，參考最優(yōu)色譜條件進樣分析，通過標準曲線分別計算2種功效成分的SRSD（n=10），SRSD值均小于5%，表明該方法的重復性好，精密度高。具體數(shù)據(jù)詳見表5。

表5 精密度試驗結果

中間精密度考察，選取褪黑素片，由試驗員A和B分別獨立開展6次平行試驗，測定褪黑素和維生素B6含量，中間精密度結果如表6所示。由表6可知，該方法測定的褪黑素和維生素B6中間精密度符合方法驗證要求。

表6 中間精密度結果

2.2.6 耐用性結果

因此方法在2.1小節(jié)中已對前處理方法進行了考察，故此耐用性試驗僅針對儀器的色譜條件進行考察。取褪黑素片樣品，按1.3.3小節(jié)配制成供試品溶液，參考1.3.1小節(jié)的色譜條件，分別設置2，5和10 μL進樣量，設置25，30和35 ℃柱溫條件上機測定，考察此方法的儀器參數(shù)耐用性。檢測數(shù)據(jù)詳見表7。由表7可知，不同色譜條件下褪黑素和維生素B6測定結果SRSD均小于5%，故此方法具有較好的耐用性。

表7 不同進樣量和色譜條件下褪黑素和維生素B6測定結果

2.3 不確定度評定結果

由1.3.4小節(jié)不確定度評定數(shù)學模型可知，褪黑素和維生素B6的不確定度主要由標準物質(zhì)、樣品前處理過程、重復測定、回收率及液相色譜儀引入。根據(jù)建立的模型，采用合成相對標準不確定度按式（2）計算。

式中：urel(x)為合成相對標準不確定度；ur(x1)為由標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度；ur(x2)為由樣品提取引入的相對標準不確定度；ur(x3)為由人員操作引入的相對標準不確定度；ur(x4)為由回收率引入的相對標準不確定度；ur(x5)為高效液相色譜儀引起的標準不確定度。

2.3.1 標準物質(zhì)引入的標準不確定度

褪黑素和維生素B6標準物質(zhì)的不確定度來源主要是標準溶液配制過程中使用的標準物質(zhì)、容量瓶、吸量管、天平引入的不確定度。

褪黑素和維生素B6標準品純度分別為P(m)=99.6%和P(v)=100%，擴展不確定度均為2.0%，按矩形分布，褪黑素和維生素B6純度帶來的不確定度分量按式（3）和（4）計算。

所用天平為十萬分之一電子天平，稱取12.95 mg褪黑素，15.44 mg維生素B6，該天平經(jīng)檢定合格，校準證書標明擴展不確定度為0.03 mg，k=2，稱量時需要去皮，則產(chǎn)生兩次稱量，其相對標準不確定度按式（5）和（6）計算。

標準溶液配制稀釋過程中由容量瓶引入的不確定度，使用50.00 mL和25.00 mL容量瓶各一次，10.00 mL容量瓶6次，根據(jù)計量證書所示，50.00，25.00和10.00 mL容量瓶的示值誤差不確定度U50=0.02 mL、k=2，U25=0.01 mL、k=2，U10=0.007 mL、k=2，則相對不確定度按式（7）計算。

標準溶液配制稀釋過程中使用吸量管1，5和10 mL，根據(jù)計量證書所示，1，5和10 mL吸量管的示值誤差不確定度分別為：Ux1=0.003 mL、k=2；Ux5=0.01 mL、k=2；Ux10=0.02 mL、k=2。標準母液使用10 mL吸量管2次，工作液有6個點，配制過程中1 mL吸量管使用了3次，吸取體積分別為0.25，0.5，1和5 mL的吸量管使用了3次，吸取體積分別為2，3.5和5 mL，則相對不確定度按式（8）計算。

溶液溫度與校準溫度不同產(chǎn)生的相對標準不確定度由于此實驗室溫度在（20±5）℃波動，液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，故只考慮前者即可。所使用的容量瓶體積為50 mL，參考甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.18×10-3℃，按矩形分布，則因溫度波動引入的液體體積的相對不確定度為按式（9）計算。

因?qū)嶒炇覝囟炔▌臃秶恢拢屎罄m(xù)對溫度引起體積變化的不確定將引用此處評估的相對不確定度。綜上，標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度按式（10）（11）計算。

2.3.2 樣品前處理過程引入的不確定度

試樣稱量過程使用的萬分天平，根據(jù)計量證書所示，天平的擴展不確定度U=0.000 5 g，k=2，稱量的平均質(zhì)量為0.512 5 g，稱量時需要去皮，則產(chǎn)生兩次稱量，其引入的相對不確定度按式（12）計算。

試樣定容過程中使用100.00 mL和10.00 mL容量瓶，根據(jù)計量證書所示，容量瓶的擴展不確定度U100=0.03 mL、k=2，U10=0.007 mL、k=2，定容體積為100.00 mL；引用2.3.1小節(jié)溶液溫度與校準溫度不同產(chǎn)生的相對標準不確定度為0.35%，則樣品定容引入的相對不確定度按式（13）計算。

綜上，樣品前處理引入的相對標準不確定度按式（14）計算。

2.3.3 重復性引入的不確定度

重復測量10次，結果詳見2.2.4小節(jié)表4，實際檢測中測試結果為2次測量結果的平均值，引用表4中的相對標準偏差，則重復性引入的相對不確定度按式（15）和（16）計算。

2.3.4 回收率引入的相對標準不確定度

回收率測試7次，結果詳見2.2.5小節(jié)表5，褪黑素和維生素B6的平均回收率分別為97.2%和98.5%，則回收率引入的相對不確定度按式（17）和（18）計算。

2.3.5 高效液相色譜儀引入的相對標準不確定度

由高效液相色譜儀的說明書可知，該儀器檢測濃度的允許誤差為1%，按均勻分布處理。則按式（19）計算。

2.3.6 褪黑素和維生素B6合成總相對不確定度

褪黑素和維生素B6合成總相對不確定度為按式（20）和（21）計算。

2.3.7 褪黑素和維生素B6擴展不確定度

此次試驗取包含因子k=2，包含概率P=95%時，褪黑素和維生素B6的擴展不確定度分別為5.10%和4.68%，樣品中褪黑素的含量表示為5.21±0.27 mg/g，k=2，維生素B6的含量表示為5.43±0.25 mg/g，k=2。

3 結論

研究表明，褪黑素片中褪黑素和維生素B6可實現(xiàn)同步測定提升日常檢測效率。通過對此研究過程的試驗數(shù)據(jù)分析，此方法具有較好的準確度和精密度。此方法不確定度的主要來源為人員操作及回收率引入的隨機誤差，標準品、天平、移液管、容量瓶、液相色譜儀帶入的系統(tǒng)誤差。比較相對不確定度分量發(fā)現(xiàn)，隨機誤差對結果影響較大，故檢測過程中需要嚴格規(guī)范操作過程并遵守，系統(tǒng)誤差中標準物質(zhì)對結果影響較大，需盡可能選擇不確定小的標準物質(zhì)，同時使用偏差小的量器具和設備、控制實驗室溫度，提升檢測結果的穩(wěn)定性和可靠性。