單因素結合響應面法優化魔芋多酚含量測定方法

付鎵榕，徐榮，郭剛軍，馬尚玄，鄒建云

云南省熱帶作物科學研究所（景洪 666100）

魔芋是天南星科（Araceae）魔芋屬（Amorphophallus）多年生草本植物。全球有魔芋220余種，其中我國就有25種，主要分布在西南和華南地區，云南省有15種魔芋資源，為魔芋資源最豐富的省份[1]。魔芋作為我國的傳統中藥材，有著悠久的歷史，涉及種植、食用及藥用，據《開寶本草》和《本草綱目》中的記載，魔芋性寒、味平，有化痰、行瘀消腫的作用，可以治療跌打損傷、咳嗽、癰腫風毒、瘧疾、積滯等疾病。在現代研究發現，魔芋對肝臟[2]、肥胖[3]、糖尿病[4]、炎癥性腸病[5]等方面均有治療作用。除食用和藥用價值外，魔芋葡甘露聚糖（Konjac Glucomannan，簡稱KGM）還可作為天然高分子材料，在食品、醫藥、化工等領域有廣泛應用[6]。

目前，魔芋的化學成分的研究報道主要以脂肪、蛋白質、粗纖維、葡甘聚糖、淀粉等為主[7-10]，由于KGM為主要成分且具有較高的經濟價值高，故其它成分的用途開發較少，特別是對其藥用方面的開發利用極少[11]。植物多酚具有防止心腦血管疾病[12]、抗腫瘤[13]、抗氧化活性[14]等功效，而對于魔芋多酚的研究較少。只有對多酚的含量進行準確測定，才能對多酚提取技術、多酚產品的制備、功效等展開研究。Folin-Ciocalteu比色法是目前多酚測定主要采用的方法，但不同樣品選用的檢測條件差異較大，比如碳酸鈉溶液的濃度及用量，顯色溫度也不同主要在30～50℃之間，顯色時間也從30到120 min不盡相同[15-18]。目前對魔芋多酚的定量測定方法優化尚未見報道，因此很有必要對Folin-Ciocalteu比色法的測定條件進行系統分析，以確定最優的檢測條件。

文章通過單因素試驗結合響應面法建立了Folin-Ciocalteu比色法測定魔芋多酚含量的方法，并對該方法的穩定性、精密度、重復性、回收率進行考察。通過研究為魔芋的成分分析提供理論依據，期望提升魔芋的綜合利用率增加魔芋的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用彌勒魔芋（云南省熱帶作物科學研究所試驗基地）；福林酚試劑（Folin-Ciocalteu試劑）（國藥集團化學試劑有限公司）；沒食子酸（3, 4,5-三羥基苯甲酸）標準品（Sigma公司）；無水碳酸鈉、無水乙醇等試劑（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

BGZ-70電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司）；HHS恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司）；ME204E電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500VDE超聲波清洗機（昆山市超聲儀器公司）；T-UV1810紫外分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；114B粉碎機（永歷制藥機械有限公司）。

1.3 魔芋多酚的提取

將清水洗凈的魔芋球莖去皮切成3～5 mm薄片，于電熱恒溫鼓風干燥箱中80 ℃烘至恒重，粉碎過篩制得魔芋粉，備用。參照尹娜等[19]的試驗方法稍作修改，準確稱取魔芋粉5 g于100 mL容量瓶中，加入體積分數為60%乙醇定容，超聲波提取30 min，靜置30 min后取50 mL上清液于容量瓶中，用蒸餾水定容至250 mL，制得多酚提取液，備用。

1.4 魔芋多酚測定條件的優化

1.4.1 最佳測定波長的確定

分別準確移取1.0 mL魔芋多酚提取液和40 μg/mL的沒食子酸標準溶液到10 mL容量瓶內，再分別加入1.0 mL福林酚試劑、5 mL蒸餾水、3 mL 5%的碳酸鈉溶液，在50 ℃水浴60 min，用分光光度計在400～1 000nm下進行吸收光譜掃描，確定最佳測定波長。

1.4.2 碳酸鈉溶液用量的確定

分別準確移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶內，再分別加入1.0 mL福林酚試劑，然后分別加入1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5和5 mL 5%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10 mL，50 ℃水浴反應60 min后在769 nm波長處測吸光度，以確定5%碳酸鈉溶液的最佳用量。

1.4.3 福林酚試劑用量的確定

分別準確移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶內，再分別加入0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75和2 mL福林酚試劑，然后分別加入5%碳酸鈉溶液3 mL，蒸餾水定容至10 mL，50 ℃水浴反應60 min后在769 nm波長處測吸光度，以確定福林酚試劑的最佳用量。

1.4.4 反應溫度與時間的確定

準確移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶內，再依次加入1.25 mL福林酚試劑，3 mL 5%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10 mL后分別置于25，30，35，40，45，50，55，60，65和70 ℃水浴反應，測定其分別反應20，40，60，80，100和120 min后在769 nm波長處測吸光度，以確定最佳反應溫度與時間。

1.4.5 響應面優化試驗設計

根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素的基礎上，選擇5%碳酸鈉用量、福林酚試劑添加量、反應溫度3個因素，進行三因素三水平的響應面分析，因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平與編碼值

1.5 測定方法的評價

1.5.1 穩定性試驗

取1.3小節中制備的樣品提取液，按照1.4.5小節響應面試驗確定的最佳測定條件進行反應，靜置0，1，

2，3，4和5 h后再次測量其吸光度，計算出每次測定的相對標準偏差，以評價該檢測方法在靜置一定時間后的穩定性。

1.5.2 精密性試驗

采用試驗確定的最佳測定條件對同一魔芋樣品提取液進行10次多酚含量測定，計算相對標準偏差，評價該測定方法的精密度。

1.5.3 重復性試驗

取5份同一魔芋樣品，按照1.3.1小節中的方法制備提取液，用試驗確定的最佳測定條件測定吸光度，計算相對標準偏差，評價該測定方法的重現性。

1.5.4 沒食子酸加標回收試驗

取6份已知多酚含量的魔芋提取液，分別加入不同質量的沒食子酸標準品，然后按照試驗確定的最佳測定條件測定其多酚含量，計算平均回收率及相對標準偏差，評價該測定方法的準確性。

1.6 樣品多酚含量的測定

1.6.1 沒食子酸標準曲線的繪制

準確稱取10 mg沒食子酸，用蒸餾水溶解，并定容至100 mL，得到100 μg/mL的沒食子酸標準溶液。分別移取1，2，3，4，5，6，7，8，9和10 mL到10mL容量瓶中，蒸餾水定容，得到沒食子酸的質量濃度分別為10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL。

分別取1 mL各濃度的沒食子酸標準溶液于10 mL容量瓶中，依次加入福林酚試劑1.2 mL，5%的碳酸鈉溶液2.75 mL，蒸餾水定容至10 mL，62 ℃水浴60 min，以蒸餾水做參比，在769 nm下測定吸光度，以吸光度為縱坐標（Y），反應體系中沒食子酸質量濃度為橫坐標（X），建立的回歸方程為。

1.6.2 樣品的測定

準確取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，加入1.2mL 1 mol/L福林酚試劑，然后加入2.75 mL 5%的碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10 mL，62 ℃水浴60 min，以蒸餾水做參比，在769 nm下測定吸光度，用標準曲線回歸方程計算得到魔芋提取液的多酚含量。

1.7 數據分析

采用Excel 2019進行數據錄入、分析；使用Origin 2021對進行作圖；用Design-Expert 13統計軟件進行響應面優化分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 檢測波長的確定

在堿性環境中多酚類化合物被鎢鉬酸氧化，而鎢鉬酸被還原（使W6+變為W5+）生成藍色的化合物，藍色的深淺程度代表著多酚類化合物的含量[20]。將顯色反應后的沒食子酸溶液和魔芋試樣溶液分別用紫外分光光度計于400～1 000 nm波長進行光譜掃描，選出最佳檢測波長，結果如圖1所示，769 nm處為沒食子酸和魔芋試樣溶液的最大吸收峰，因此選擇769 nm作為檢測波長。

圖1 標準溶液和樣品溶液的吸收光譜

2.1.2 碳酸鈉溶液用量的確定

多酚類化合物與福林酚試劑中的鎢鉬酸反應必須在堿性條件才可以顯色，碳酸鈉溶液是顯色反應中的支持介質，碳酸鈉溶液加入量的多少將影響反應體系中堿性的強弱，對顯色反應有很大的影響。碳酸鈉溶液過量會析出晶體，使吸光度降低[21]。加入不同量5%碳酸鈉溶液對吸光度的影響如圖2所示，隨著碳酸鈉溶液用量的增加，反應液的吸光度總體呈現出先上升后下降的趨勢，當碳酸鈉溶液用量為3 mL時，反應液的吸光度最大，故碳酸鈉的用量選擇為2.5～3.5 mL較為合適。

圖2 碳酸鈉用量對吸光度的影響

2.1.3 福林酚試劑用量的確定

福林酚試劑用量決定著多酚化合物是否完全氧化，對顯色反應有直接影響。不同的福林酚試劑加入量對吸光度的影響如圖3所示，福林酚試劑用量在0.25～1.25 mL的范圍內，隨著用量的增大，反應液的吸光度逐漸增大，當福林酚試劑用量大于1.25 mL，反應液的吸光度急劇下降后趨于平緩。吳澎等[21]在櫻桃酒中總酚含量測定中發現福林酚試劑用量過大會使溶液呈現淡綠色引起吸光度出現下降，作者認為當顯色劑過量后反應體系將呈現出顯色劑本身的顏色。為確保測定方法的靈敏度高，選擇的福林酚試劑用量為

圖3 FC試劑用量對吸光度的影響

1～1.5 mL。

2.1.4 反應溫度與時間的確定

提取液中的多酚化合物與加入的福林酚試劑反應需要一定的溫度及時間。不同反應溫度在不同反應時間的吸光度如圖4所示，在25～45 ℃條件下反應，吸光度隨顯色時間的延長而逐漸增大，無相對穩定時間；75 ℃條件下反應60 min后，吸光度隨水浴時間的延長而逐漸降低，說明溫度高能加快顯色進程，但溫度過高會導致反應體系的穩定性較差，50～70 ℃條件下反應，顯色60 min后，體系吸光度變化很小，表明顯色反應基本完全，顯色體系穩定性很好，其中65 ℃條件下顯色后吸光度較高且穩定性好，故選擇的反應溫度范圍為60～70 ℃，確定60 min作為反應時間。

圖4 反應溫度與時間對吸光度的影響

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 試驗結果與方差分析

利用Design Expert 13軟件對三因素三水平進行響應面分析，響應面試驗設計及試驗結果如表2所示。對試驗數據進行二次多項式擬合，得到回歸模型方程：吸光度（Y）=-2.24+0.17A-1.35B+0.096C+0.26AB-0.004 3AC+0.015BC-0.038A2-0.13B2-0.000 76C2。

表2 響應面試驗設計及結果

根據表3分析可知，二次回歸模型的F=196.19（P＜0.01），表明該模型達到極顯著水平；失擬項表示模型中數據的變異，失擬項差異不顯著（P＞0.05），試驗理論和實際值偏差很小，得到的回歸模型能夠很好地的預測響應值。試驗模型的決定系數R2=0.996 1，說明魔芋多酚含量的測定結果與模型預測結果具有良好的一致性，校正系數0.991 0也進一步驗證了該模型的可靠性。通過回歸方程中F值判斷各因素對魔芋中多酚檢測的影響主次順序為C＞B＞A。通過回歸模型方差分析得到模型的一次項中碳酸鈉用量、福林酚試劑用量、反應溫度對魔芋中多酚的測定結果影響均為極顯著（P＜0.01），交互項中AB、AC、BC對試驗結果的影響極顯著（P＜0.01），二次項中A2、B2、C2對試驗結果影響均為極顯著（P＜0.01）。

表3 回歸模型方差分析表

2.2.2 響應面圖形分析

響應面3D曲面圖的形狀反映了各因素交互作用對響應值的影響，結果如圖5～圖7所示。對魔芋中多酚含量測定的交互項進行考察，響應面圖可以評價試驗中設置的試驗因素對魔芋中多酚含量測定的交互作用[22]，響應面的坡度越陡，說明該因素對魔芋中多酚含量測定的影響越大[23-24]；反之則表明該因素對魔芋中多酚含量測定的影響越小[21,25]。在交互項對測定濃度的影響中，碳酸鈉用量與福林酚試劑用量、碳酸鈉用量與反應溫度、福林酚試劑用量與反應溫度的交互作用均顯著，這與方差分析的結果相符。

圖5 碳酸鈉用量和福林酚試劑用量響應面

圖6 碳酸鈉用量和反應溫度響應面

圖7 福林酚用量和反應溫度響應面

2.2.3 最佳測定條件的確認

利用Design Expert 13軟件對數據進行分析處理，最佳測定條件為5%碳酸鈉溶液用量2.756 mL、福林酚試劑用量1.205 mL、反應溫度62.44 ℃。在此條件下，預估的吸光度為0.430。參照分析得出的最佳測定條件，在實際操作中稍作調整：5%碳酸鈉溶液用量2.75 mL、福林酚試劑用量1.20 mL、水浴反應溫度62 ℃，進行5次平行試驗進行驗證，所測得的吸光度平均值為0.419±0.001，驗證試驗的結果與分析得出的預估值相近，吻合度達97.35%，說明該模型具有很好的預測性，結果穩定可靠。

2.3 測定方法的評價

2.3.1 穩定性試驗

取制備好的魔芋多酚提取液，按照最佳測定條件進行穩定性試驗，在與顯示劑反應完全后避光放置，不同時間后測定吸光度見表4。隨著時間的延長，吸光度有緩慢上升的趨勢，但幅度不大，相對偏差為2.13%，說明該方法在一定時間內穩定性較好。

表4 穩定性試驗

2.3.2 精密性試驗

根據響應面法優化的最佳測定條件進行精密性驗證試驗，對同一個提取液樣品進行10次測定，結果如表5所示。相對偏差為0.75%，說明該方法具有較高的精密度，能滿足魔芋多酚的測定要求。

表5 精密性試驗

2.3.3 重復性試驗

取5份魔芋多酚提取液，用響應面法優化的最佳測定條件測定其多酚含量，結果見表6。相對標準偏差為0.80%，說明該方法具有較好的重現性。

表6 重復性試驗

2.3.4 加標回收試驗

在6份1 mL的魔芋多酚提取液中分別加入10，20，30，40，50和60 μg的沒食子酸標準品，按照響應面法優化的最佳測定條件進行3次檢測，試驗結果見表7，加標回收試驗的回收率最高為101.22%，最低為97.99%，平均回收率為100.07%，相對標準偏差為1.20%。進一步證明了該檢測方法的穩定性。

3 結論

魔芋中多酚檢測中反應溫度對魔芋中多酚測定的影響最大，其次為福林酚試劑用量，碳酸鈉用量的影響最小。參照響應面分析結果，將實際測定條件稍作調整，確定的測定條件為5%碳酸鈉溶液用量2.75 mL、福林酚試劑用量1.20 mL、反應溫度62 ℃，待其反應60 min后在波長769 nm處測定吸光度。測定方法評價結果表明該檢測方法操作過程簡單、便捷，重復性、穩定性好，精密度、回收率高，檢測結果準確可靠，可為魔芋研究提供試驗參考。