基于高通量基因測序分析火鍋蘸料原料微生物多樣性

張隋鑫，陳臘梅，王宇，楊瑞香，薩如拉，紀曉梅

內蒙古草原紅太陽食品股份有限公司（呼和浩特 010000）

火鍋是近年來風靡全國各地的美食，火鍋蘸料是火鍋的靈魂搭配，它可與肉類、豆制品、蔬菜等搭配，緩解火鍋帶來的辛辣感、刺激感[1]。火鍋蘸料產品的品質和風味將直接影響消費者對火鍋食用興趣[2]。火鍋蘸料的原料種類復雜，原料微生物是影響食品生產的基礎，未殺滅的微生物會在食品中繼續繁殖導致食品腐敗，在生產過程中若出現滅菌不徹底，易出現食品安全問題。國內外對于火鍋類產品的研究主要集中在對火鍋底料生產工藝優化、新品的開發等方面[3-7]，對于火鍋蘸料原料微生物方向的相關研究還比較少[8]。

高通量測序技術（High-throughput sequencing）是一種高效便捷檢測樣品DNA分子的方法，它代替傳統繁瑣的檢測步驟[9]，在檢測樣品時具有需求量少、檢測速度快、結果準確率高等優點[10]，但其無法對產品中的微生物是否還存活進行判斷。高通量測序可針對不同食物中的復雜微生物進行準確識別，被廣泛應用于多種食品中，如豆豉[11]、泡菜[12]、酸菜[13]、發酵香腸[14]、腐乳[15]等。近年來利用該項技術對微生物分子生態學進行研究成為首選的方法[16]。試驗采用高通量測序技術，探究蘸料原料的微生物菌群組成，了解原料中的優勢菌種，從而為提高生產過程中的安全性和穩定性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（A）蘸料半成品、（B）花生醬（花生仁經烘烤研磨后制得）、（C）韭菜花（韭菜花經腌制后獲得）、（D）香辛料（桂皮、姜粉、茴香等）、（E）大豆粉（黃豆經烘烤后研磨制得），均由內蒙古呼和浩特市草原紅太陽食品股份有限公司提供。

Q10212 Qubit3.0 DNA檢測試劑盒（美國Life Technologies公司）；M5635-02 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit（美國OMEGA公司）；P111-03 2×Taq Master Mix（中國Vazyme公司）；EC401-03 MagicPure Size Selection DNA Beads（中國TransGen Biotech公司）。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；GL-88B漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；DYCZ-21電泳槽（北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統（美國UVP）EC3 310；T100TM Thermal Cyeler PCR儀（美國BIO-RAD公司）；Research plus 0.5～10 μL移液器（中國Eppendorf公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

稱取200 mg原料樣品，分別將5種原料加入已滅菌的離心管中，向離心管中加入1 mL 70%乙醇溶液，充分振蕩使樣品混合均勻，在10 000 r/min轉速、室溫下離心3 min，將上層液體棄置。向離心管中加入1倍的磷酸鹽緩沖液，充分振蕩使樣品混合均勻，在10 000 r/min轉速、室溫下離心3 min，將上清液棄置。將離心管倒置于濾紙上方，保持1 min，直至離心管內沒有液體流出。將樣品管在50 ℃烘箱靜置10 min，使離心管內殘留的乙醇溶液完全揮發。

1.3.2 DNA提取

將蘸料半成品（A）、花生醬（B）、韭菜醬（C）、香辛料（D）、大豆粉（E）編號的火鍋蘸料原料樣品分別攪拌均勻，參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書，結合SDS裂解液凍融法對5種原料進行DNA提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，條帶清晰即可進行后續操作。

1.3.3 PCR擴增及測序

利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，明確PCR反應需加入的DNA量。PCR所用的引物已經融合Miseq測序平臺的V3-V4通用引物[17]：341F引物，CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物，GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC，進行擴增。DNA模板10 μL，高保真PCR試劑15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），H2O 30 μL。將配制好的PCR體系進行第1輪PCR擴增，反應條件：預變性94 ℃保持3 min后分別進行變性、退火及延申操作，循環5次（變性溫度94 ℃、時間30 s，退火溫度45 ℃、設定時間20 s，延伸溫度65 ℃、時間30 s）；進行變性、退火及延申操作，循環20次（變性溫度94 ℃、時間20 s，退火溫度55 ℃、時間20 s，延伸溫度72 ℃、時間30 s）；延伸操作（溫度72 ℃保持5 min）。

第2輪擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR 產物（第1輪）20 ng，高保真PCR試劑15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），H2O 30 μL。將配制好的PCR體系進行PCR擴增，反應條件：預變性溫度95 ℃、時間3 min，分別進行變性、退火、延伸操作，循環5次（變性溫度94 ℃、時間20 s，退火溫度55 ℃、時間20 s，延伸溫度72 ℃、時間30 s），最終進行延伸操作（溫度72 ℃、時間5 min），經過PCR擴增后，PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測。使用Qubit 3.0檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，在Illlumina NovaSeq 6000 pair-end 2×150 bp平臺進行雙端測序。

1.4 數據處理

基于Illumina Miseq平臺測序得到的樣品文庫，根據Barcode序列和PCR擴增引物序列區分各樣本數據，對樣本數據的質量進行質控過濾，得到各樣本有效數據。將最終優化數據進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，根據分析結果，采用Mothur 計算分析樣品的Alpha多樣性，分別繪制樣品各分類學水平下的群落結構圖、Heatmap熱圖、結合基于bary-curtis距離算法的PCA圖，分析微生物結構組成差異。

2 結果與分析

2.1 火鍋蘸料5種原料瓊脂凝膠電泳鑒定

火鍋蘸料5種原料PCR擴增產物瓊脂凝膠電泳結果如圖1所示。5個蘸料原料樣本的PCR擴增產物條帶在600 bp左右，與設計引物擴增長度接近，且其特異性和亮度均較好，可滿足測序要求。

圖1 細菌PCR擴增結果電泳圖

2.2 火鍋蘸料主要原料的測序結果質量分析

采用高通量測序獲得火鍋蘸料原料樣品的原始序列數據后，得到5個樣品細測的序列，共2 706 867條，其中樣本細菌長度分布在425～446 bp，通過過濾篩除低質量序列，得到有效序列，共253 345條，長度分布在406～409 bp。數據經過預處理，最終得到的優質細菌序列分布統計見表1。

表1 細菌序列信息

2.3 蘸料中5種原料微生物多樣性的分析

2.3.1 樣品的OTU統計及分析

采用OUT統計工具，將幾個樣本的測序結果按照操作提示錄入工具中，分別對測序結果篩選出來的細菌真菌有效序列進行聚類，結果如圖2所示。樣品細菌在OTU聚類后共得到1 732個OTUs，5個原料樣品中有3個OTUs為原料共有，樣品A特有OUT 151個，B特有OUT 105個，C特有31個，D特有442個，E特有16個，5個檢測樣本共有OUT 3個。

圖2 樣品OTU分布韋恩圖

2.3.2α多樣性分析

α多樣性常用的度量標準包括Sobs指數、Chao指數、Shannon指數、ACE指數、Simpson指數和覆蓋率。Sobs指數是指觀測到的樣本OTU數量，OTU數量可以代表樣品物種的豐富度，每個OTU對應不同的微生物種[18]。Shannon指數和Simpson指數表示樣品的多樣性[19]，ACE指數和Chao指數表示物種的豐富度，通過檢測和測序得到物種的覆蓋率。Chao、ACE指數用于計算菌群豐度（community richness），二者指數越大，說明群落豐富度越高[20-21]。Shannon的值越大，說明檢測樣本的群落多樣性越高，Simpson的指數值越大，則說明檢測樣本其群落多樣性越低[22]。

如表2所示，樣品D（香辛料）Shannon指數為3.87，明顯較其他原料高，而樣品B的Shannon指數較低，為2.00，且樣品A的Shannon指數為2.12，樣品E的Shannon指數為2.11，較相近并大于樣品B的2.00，說明樣品D中細菌群落的多樣性較高、種類多，且樣品D的ACE指數為388.29，Chao指數為2 124.40，也間接說明樣品D香辛料中所含的物種豐富度較好，可能原因是原料自帶的微生物較多，原料的生長環境也更適宜細菌生長繁殖，因此在生產中不但要加強原料的滅菌，還要著重把控好環境中的微生物。樣品B的Simpson指數較高，Shannon指數較低，也說明該原料中細菌群落多樣性較少，主要原因為原料較為單一。

表2 細菌α多樣性指數

由圖3的Rank abundance曲線可知，5個樣品曲線跨度均較大，說明5種原料的微生物組成均較為豐富，均勻程度較高，其中大豆粉（E）的曲線水平跨度最低，曲線也較為平緩，說明微生物的豐富度較低，而樣品香辛料（D）的水平跨度較大，曲線較為平緩，說明其原料中微生物的物種組成較為豐富，花生醬（B）的樣品物種數量下滑曲線平滑，且曲跨度較小，說明較蘸料半成品（A）、韭菜花（C）、香辛料（D）、大豆粉（E）要好，也更加說明原料B（花生醬）的優勢菌群占比較高，可能由于原料中的某一種或幾種微生物所占比例較大，該原料的優勢菌群占比較高，也間接說明該原料中的微生物多樣性較低。

圖3 高通量測序樣本的Rank-abundance曲線

2.3.3 基于屬水平的火鍋蘸料原料菌群結構分析

在屬分類水平上，5個火鍋蘸料原料樣本共檢測到21個細菌屬。從圖4可以看出，假單胞菌屬（Pseudomonas）和黃桿菌屬（Xanthomonas）是5種原料中的絕對優勢菌屬，假單胞菌屬（Pseudomonas）具有重要且多樣的生態功能，更重要的是假單胞菌具有極強的環境適應性，分布十分廣泛，其生長溫度、pH適應范圍較大[23]。Pseudomonas除D（香辛料）中占比在20%左右外，其余原料中均占到50%以上。原料D（香辛料）中的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea），屬于兼性厭氧菌，因此在進行生產過程中要著重注意該原料的滅菌時間及溫度。

圖4 細菌屬水平的群落分類學組成和相對豐度分布

在屬分類水平下，將火鍋蘸料5種原料的細菌的群落組成按照最大相對豐度順序排序，并繪制5種原料的物種豐度聚類熱圖，如圖5所示。Heatmap圖是以顏色梯度來表征二維矩陣或表格中的數據大小[24]，并呈現群落物種組成及物種的豐度信息，通過利用顏色的深淺變化方式反映所檢測樣本的細菌群落分布的豐度值[25]。從圖5可以看出，韭菜花（C）和大豆粉（E）樣品的細菌菌群豐度值較為接近，且相對豐度較小。而原料A（蘸料半成品）與原料B（花生醬）樣品的相對豐度較大，主要是以假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）為主，在火鍋蘸料主要原料中原料D（香辛料）的細菌菌群豐度與其他原料的菌群豐度有較明顯的差異，原料D（香辛料）主要是以泛菌屬（Pantoea）和耶爾森菌屬（Yersinia）等為主。通過Heatmap圖分析表明，火鍋蘸料5種原料樣品中的細菌菌群豐度存在明顯差異，說明不同原料在生產過程中所需的滅菌溫度和時間需有針對性地把控，以保障產品生產安全。

圖5 細菌屬水平群落結構Heatmap圖

2.3.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

X軸和Y軸表示2個選定的主成分軸，百分比表示主成分對樣本組成差異的解釋度值，通過主成分PCA分析，可以觀察各樣本間的離散和聚集情況[26]。圖6中有5種形狀方向各異的小圖形，這些小圖形分別表示火鍋蘸料5種原料的樣本來源，各點之間的距離大小，反映相應樣本之間的菌群差異情況[27]。反之，若2個點之間的距離較為相近，則表明2個樣本的物種組成越相似[28]。

圖6 細菌群落結構的PCA分析

基于屬水平條件對火鍋蘸料的5種原料進行主成分（PCA）分析，分析結果如圖6所示。PCA1的貢獻率為89%，PCA2的貢獻率為9%。在PCA分析結果中，樣本B和樣品A之間距離較小，表明這2種原料的原始菌落組成差異較小，而原料D樣品距其他樣品的距離較遠，說明該原料樣本的菌落組成與其他4種原料差異較大，分析原因可能是原料D為農業原料組成，生長環境較復雜，菌屬涵蓋范圍較大。從整體看，5種原料微生物差異較大。根據圖6可知，B、A樣品菌群結構相近，與C、E原料樣品的差異較小，與D原料的差異較大。這與屬水平群落結構Heatmap圖結果相同。

3 討論與結論

采用高通量測序法對紅太陽火鍋蘸料5種主要原料的微生物群落結構進行檢測，結合α多樣性分析和Heatmap圖表明，5種原料的菌群組成非常復雜，種類多，數量大，范圍廣。食品腐敗的主要原因是產品中殘留的微生物的代謝活動引起的食品酸敗變質，利用高通量基因測序技術對火鍋蘸料中5種主要原料微生物的多樣性和豐度進行鑒定，分析可能影響火鍋蘸料品質的菌株，為火鍋蘸料生產過程的把控提供理論支持，為火鍋蘸料的安全生產提供科學依據。在火鍋蘸料的5種原料中假單胞菌屬（Pseudomonas）都是優勢菌種，而假單胞菌屬（Pseudomonas）是一種腐敗微生物，其含量超標在食用時會對人體健康造成一定影響。

通過高通量基因測序在蘸料原料中發現大量假單胞菌屬（Pseudomonas），且有報道證明人體在食用含有假單胞菌屬（Pseudomonas）食物會導致腹瀉的發生[29-31]，而一些原料中自帶的微生物為不可控因素，無法在入場時保障菌落總數＜10 CFU，但在生產過程中此類微生物均可通過高壓滅菌處理殺滅。通過高通量測序技術對火鍋蘸料的微生物進行鑒定，了解火鍋蘸料5種主要原料的微生物菌群結構組成多樣性，可在其他種類蘸料生產中參考此原料的主要優勢菌種，根據這些微生物的生存特性對其進行控制，并殺滅有害菌群，保障食品生產的安全性。