中藥梔子治療IgA 腎病的網絡藥理學研究?

龐欣欣，王學藝，朱 清，商海濤，彭紫凝，韓佳瑞△

1 河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450002；2 河南中醫藥大學第二臨床醫學院，河南 鄭州 450046

IgA 腎病（immunoglobulin A nephropathy，IgAN）是最常見的原發性腎小球腎炎，也是慢性腎臟病和終末期腎臟病的主要病因［1］。IgAN的病理特征是在腎小球系膜區以IgA 沉積為主，臨床表現為血尿，可伴有蛋白尿、高血壓和腎功能受損等表現［2-3］。IgAN 的發病機制尚不清楚，有關IgAN的多種假說尚不能解釋IgA 沉積相關的腎損害，目前的治療方法尚不能阻斷IgAN 的進展［4-5］，約15%～40%的患者在確診十年內發展成終末期腎病［6］。

中醫藥對IgAN 的治療有獨特的優勢。IgAN中醫辨證大多為本虛標實、虛實夾雜。濕熱證是IgAN的重要證型［7-8］。梔子味苦性寒，入心、肺、三焦經，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，主治熱病心煩、黃疸尿赤、血淋澀痛、熱毒瘡瘍等。藥理研究表明，梔子有抗炎、抑制氧化應激、降低膽固醇和低密度脂蛋白、改善血管內皮功能紊亂等作用［9］。國醫大師張琪教授在辨治IgAN 尿血時，對辨證屬瘀熱互結或腎陰虧虛者，在經驗方中均用梔子清熱解毒［10］。本研究通過網絡藥理學的方法挖掘梔子治療IgAN 的有效成分及作用靶點，同時構建梔子有效作用靶點與IgAN 疾病靶點的蛋白互作網絡，預測梔子治療IgAN 的相關靶點。進一步對這些靶點進行疾病-藥物-分子-靶點互相作用的可視化分析、基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，為梔子治療IgAN 的作用靶點和機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 對梔子有效成分的篩選通過檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）挖掘梔子的所有化學成分，根據各個成分的吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）及排泄（excretion），即ADME（absorption、distribution、metabolism、excretion）參數篩選有效成分，其中篩選條件為藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，藥物相似性（drug like，DL）＞0.18［11］。

1.2 梔子的作用靶點和lgAN的相關靶點檢索采用TCMSP 數據庫，以“Gardeniae Fructus”為關鍵詞預測篩選梔子有效成分作用靶點。GeneCards是公共集成數據庫，提供了來自約150個網絡來源的以人類基因為中心的全面基因注釋和預測信息，包括基因組學、轉錄組學、遺傳信息學、臨床基因信息等［12］。以“IgA nephropathy”為關鍵詞在Gene Cards 里篩選與IgAN有關的所有靶點，并在TTD、DrugBank、DisGeNET、GAD 等數據庫中篩選補充［13］。

1.3 蛋白互作網絡構建和關鍵靶點篩選蛋白質-蛋白質相互作用關系（protein-protein interaction，PPI）是數據挖掘的重要途徑。應用STRING 數據庫預測蛋白質之間的相互關系并構建PPI 網絡，利用該數據庫構建梔子作用靶點與IgAN靶點的交集PPI網絡并篩選核心靶點［14］。篩選參數設置主要有：生物機體選擇為人類，最低要求交互分數設置最高置信度0.4。

1.4 梔子治療lgAN 網絡調控的可視化基于梔子和IgAN 的蛋白互作靶點數據，引入梔子可作用于IgAN 的有效成分，提取兩者交集，采用Cytoscape 3.7.2 軟件把這些數據制作成可視化網絡圖，其中“圓形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“邊”表示不同成分與靶點之間的關系，挖掘其相互之間的作用關系。即得到梔子治療IgAN 的疾病-藥物-分子-靶點調控網絡圖。

1.5 GO 和KEGG 富集分析DAVID 數據庫廣泛應用于基因注釋，可通過該數據庫挖掘基因與疾病的相關性。GO 分析是生物學領域中用于基因產物細胞功能、分子功能和生物功能的分類的系統，可以通過DAVID 工具進行GO 富集分析。同時，應用DAVID工具對梔子和IgAN交集蛋白靶標基因進行KEGG通路富集分析，得到梔子治療IgAN的主要作用通路。GO和KEGG富集分析，考察梔子的潛在靶標可能具有的生物學功能，參與的生物學通路［15］。校正統計學超幾何分布定量（P.adjust值）來評估存在于各GO和KEGG注釋中的蛋白生物學功能和通路富集情況的顯著性，P.adjust 值在圖中顏色越紅，則顯著性越強。

2 結果

2.1 梔子有效成分的ADME分析檢索TCMSP數據庫中梔子的所有成分，按照OB＞30%和DL＞0.18進一步篩選出梔子有效成分15個。見表1。

2.2 梔子的作用靶點和lgAN 的相關靶點檢索結果通過TCMSP 數據庫查找到15 個有效成分，其中，只有12 個有效成分具有相對應的靶點，對這12 個有效成分進行靶點基因注釋，刪去重復靶點，得到95個有效預測藥物靶點。在GeneCards、TTD、DrugBank 等數據庫中篩選IgAN 相關靶點，刪除重復數據，共得到1346 個與疾病相關的靶點。取梔子和IgAN的有效靶點交集，得到41個共同靶基因。見圖1。

圖1 梔子活性成分有效靶基因與IgAN相關靶基因

2.3 梔子-lgAN作用靶點蛋白互作關系分析取梔子和IgAN的有效靶點交集，得到41個梔子-IgAN相互作用靶點。采用STRING 數據庫進行PPI 分析，得到352條PPI關系。取其中富集節點數目最多的前30 個靶點，做出柱狀圖，得到前30 個梔子-IgAN 核心靶點。其中橫軸為富集節點數目，縱軸為靶點基因名稱。核心靶點主要有炎癥因子、血管內皮生長因子、蛋白激酶、細胞凋亡相關因子等。見圖2—3。

圖2 梔子與IgAN的PPI關系圖

圖3 梔子治療IgAN的核心作用靶點

2.4 梔子治療lgAN網絡可視化分析通過Cytoscape 軟件進行梔子治療IgAN 的網絡的疾病-藥物-分子-靶點互相作用的可視化分析。納入上述PPI 網絡篩選的41 個基因和分析篩選，得到9 個梔子可用有效成分，同時在網絡中加入疾病和藥物使網絡圖更加直觀。網絡可視化圖，見圖4。

圖4 梔子-IgAN-有效成分-靶點網絡關系圖

2.5 梔子治療lgAN 的機制分析對梔子和IgAN交集蛋白靶標基因采用DAVID 工具進行GO 分析，得到梔子可治療IgAN 的作用靶點的生物學功能77 種，綜合分析后取前10 種功能特性，得到梔子有效成分靶點主要通過這些生物學功能特性治療IgAN，如DNA 結合轉錄因子結合性、泛素連接酶結合性、泛素樣蛋白連接酶結合性、抑制轉錄因子結合性、激活轉錄因子結合性等。再采用DAVID 工具進行KEGG信號通路分析，發現梔子治療IgAN信號通路有120條，綜合分析后取前20條信號通路。KEGG分析顯示，梔子治療IgAN的有效靶點主要在晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end products，AGEs）-受體（receptor of AGEs，RAGE）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、前列腺癌、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路等。其中氣泡或柱形圖顏色越紅，則校正P值越高，顯著性越強，氣泡大小越大或柱形越長，則該生物學功能或該通路富集的靶點越多。根據排名，找到這些靶點最關鍵的AGEs-RAGE 信號通路圖，同時用紅色表示梔子靶點在該信號通路上具體作用點，見圖5—7（所有結果均符合P.adjust＜0.05）。

圖5 梔子治療IgAN的相關生物學功能

圖6 梔子治療IgAN關鍵信號通路

圖7 AGEs-RAGE信號通路圖

3 討論

含有IgA1 的免疫復合物在系膜區沉積是IgAN 的特征性病理表現［16-17］。30%～40%的IgAN患者發展為進行性腎功能下降，需要在診斷后二十年內進行腎臟替代治療。IgAN 發病機制復雜，目前尚無有效治療藥物來阻斷病情的進展［18］，因此，探索中醫藥治療IgAN的手段至關重要。

中醫中并無IgAN 的病名記載，根據臨床表現，可歸于“尿血”“水腫”“腰痛”“虛勞”“腎風”等疾病范疇［19］。羅登貴等［8］運用數據挖掘技術整理了八十余位中醫名家治療IgAN 的經驗文獻，發現風熱、濕熱、氣虛、陰虛是本病的關鍵病機，涼血止血、活血化瘀、益氣滋陰、清熱利濕、清熱解毒、補益脾腎為主要治法。劉童童等［20］分析了469 例IgAN 患者濕熱證與臨床病理的相關性，發現濕熱證的程度與IgAN 患者臨床病理的嚴重程度呈正相關。因此，濕熱證是IgAN 重要的中醫病機。濕性趨下，易侵襲下焦，阻滯氣機運行，影響臟腑氣化，濕性黏滯，易造成IgAN 的纏綿難愈，濕與熱合，如油入面，難解難分，濕欲下行而熱留之，熱欲上行而濕阻之，使疾病更加遷延難愈［21］。“治濕熱之法，以清熱利小便為最好”，梔子清熱利濕，瀉火解毒，切中IgAN病機。

梔子對IgAN 治療作用所涉及的靶點和機制目前尚不完全清楚。龐欣等［22］發現，梔子苷通過調節NLRP3來減輕IgAN模型小鼠炎癥反應和氧化應激。本研究應用網絡藥理學方法系統地預測了梔子作為IgAN 的潛在分子機制。研究發現，梔子作用機制涉及多通路、多靶點。本研究篩選梔子入血的活性成分15個，模擬預測95個有效作用的靶點和352 個相互作用關系，“活性成分-靶點”網絡分析結果顯示，包括梔子對藏紅花酸、槲皮素、山奈酚、豆甾醇等有效成分能作用于網絡中的多個靶點，比如白細胞介素6、血管內皮生長因子、細胞凋亡相關因子、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、有絲分裂原活化蛋白激酶、表皮生長因子受體等靶點。而通過針對梔子治療IgAN 的有效成分靶點進行功能富集分析，發現梔子主要通過以下這些生物學功能特性治療IgAN，如DNA結合轉錄因子結合性、泛素連接酶結合性、泛素樣蛋白連接酶結合性、抑制轉錄因子結合性、激活轉錄因子結合性等。

本研究進一步針對關鍵靶點進行通路富集分析，結果顯示，梔子治療IgAN 最關鍵的通路為AGEs-RAGE信號通路。AGEs-RAGE信號通路作用廣泛，可激活下游核轉錄因子κB，核轉錄因子NF-κB異常高表達并進入細胞核，與多種基因啟動子特異性序列結合，引起大量黏附分子、生長因子、促炎細胞因子等的表達和釋放，引起組織細胞的結構損傷和功能障礙［23-24］。AGEs-RAGE 促進轉化生長因子1 的產生，增強單核細胞趨化蛋白1 的表達，最終造成腎臟組織纖維化［23］。因此，梔子可作用于AGEs-RAGE 下游相關通路中的多個靶點從而發揮治療作用，但目前尚無AGEs-RAGE在IgAN治療中的相關研究，可作為未來研究的方向進一步研究。

綜上所述，梔子治療IgAN 主要涉及DNA 結合轉錄因子結合性、泛素連接酶結合性、泛素樣蛋白連接酶結合性、抑制轉錄因子結合性、激活轉錄因子結合性等生物學特性，并涉及AGEs-RAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、前列腺癌、腫瘤壞死因子信號通路。基于網絡藥理學和生物信息學分析能有效地揭示梔子治療IgAN 可能的作用機制，為后續進一步臨床和實驗研究設計等提供重要的理論依據，也為IgAN 的治療指明了新的方向。