基于網絡藥理學探討“金銀花-連翹”藥對防治新型冠狀病毒肺炎的作用機制?

劉晴晴，康錦花，龍文杰，寧怡樂，王陵軍，楊忠奇△

1 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405； 2 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）傳染性強，潛伏期久，人群普遍易感。該病毒是迄今第7 種可感染人類的冠狀病毒，其引發的重癥病例和病死率較高［1-3］。目前還沒有針對由新型冠狀病毒（2019 Novel Coronavirus，2019-nCoV）的特效藥，而中醫藥在此次疫情防控中發揮了極大優勢并取得了顯著療效［4-5］。銀翹散是辛涼解表類的代表性方劑，用于治療溫病初起衛分證及風熱表證，已在臨床上廣泛應用于防治COVID-19，國家衛健委發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第三版）》將其納入COVID-19 治療方案中［6］。現代藥理研究表明，該方具有顯著抗病毒、抗炎、抗菌、抗過敏、解熱及增加免疫力的作用［7］，臨床上主要用該方治療流行性感冒、腮腺炎、咽結膜炎、咽峽皰疹、麻疹、單純皰疹性角膜炎、病毒性心肌炎等病毒感染性疾病［7］。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》［8］中醫診療方案中，醫學觀察期（指疑似病例或居家自我隔離病人）有乏力伴發熱的疑似病例推薦服用中成藥有金花清感顆粒、連花清瘟膠囊（顆粒）、疏風解毒膠囊（顆粒）等，上述藥中“金銀花-連翹”均為其主要成分，故金銀花、連翹在治療COVID-19 中發揮著重要作用。本實驗旨在采用網絡藥理學的研究方法，收集“金銀花-連翹”（簡稱“銀翹”）藥對所含成分與COVID-19 相關炎癥靶點，構建“中藥-活性成分-靶點”相互作用網絡，篩選關鍵作用靶點和活性成分群，為中醫藥治療新冠肺炎提供一定的理論基礎與科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分及靶點檢索及篩選 中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）提供中藥成分數據及靶標、疾病信息?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）和類藥性（drug-likeness，DL）是進行中藥化合物篩選的關鍵指標。本研究借助TCMSP 數據庫檢索“金銀花”“連翹”，以OB≥30%和DL≥0.18［9］進行有效成分及相應靶標的查詢與篩選，在Unitprot 數據庫（http：//www.Uniprot.org/）查詢靶標蛋白的基因名字，獲取“銀翹”藥對相關靶點基因。

1.2 COVlD-19 相關靶點獲取GeneCards 數據庫（http：//www.genecards.org/）是一個整合了約150 個網絡來源的以基因為中心的綜合性在線數據庫，包括基因組、轉錄組學、蛋白質組學、遺傳、臨床和功能信息，提供所有有關注釋和預測人類基因的全面信息。本研究在GeneCards 數據庫中檢索“Novel coronavirus pneumonia”，得到與人類COVID-19相關的基因，作為COVID-19的候選靶點基因。

1.3 “藥物活性成分‐作用靶點-疾病” 網絡構建將獲得的“銀翹”藥對相關靶點與COVID-19靶點基因相映射，進行Venn 作圖分析，獲得二者交集靶點基因，然后使用Cytoscape 3.7.2 軟件進行“藥物活性成分‐作用靶點-疾病”網絡構建，根據化合物與靶點連接情況篩選出“銀翹”藥對作用于COVID-19的關鍵化合物。

1.4 靶蛋白相互作用網絡的構建及關鍵靶點篩選為了研究“銀翹”藥對治療COVID-19 的靶蛋白之間的相互作用，將藥物‐疾病交集靶點基因通過相互作用數據庫平臺STRING（http：//stringdb.org/）進行相互作用蛋白查詢并構建蛋白相互作用網絡（protein-protein interaction，PPI），物種設置為“人”（homo sapiens），最低相互作用評分設置為最高等置信度“highest confidence（0.400）”，其余參數保持默認設置，得到“銀翹”藥對防治COVID-19 的體內反應網絡。然后使用Cytoscape 3.7.2 軟件對PPI 網絡進行拓撲分析，篩選出PPI網絡中關鍵靶蛋白。

1.5 基因本體論(gene ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析GO分析主要用于注釋基因的功能，包括細胞組分、分子功能和生物過程，已被廣泛應用于生物基因功能分類。利用生物學信息注釋數據庫DAVID 6.8，以人類為研究對象，對“銀翹”藥對治療COVID-19的靶基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以研究“銀翹”藥對治療COVID-19 靶點的主要生物學過程和代謝通路。以P＜0.01 進行靶基因篩選，得到“金銀花-連翹”靶點主要的生物過程和藥理作用機制中可能性較大的通路，并進一步篩選與COVID-19 相關的信號通路，探討“銀翹”藥對治療COVID-19的生物學過程及信號通路。

2 結果

2.1 “銀翹”藥對有效成分及靶點篩選結果利用TCMSP篩選出金銀花已知成分266種，連翹已知成分150 種，通過OB≥30%和DL≥0.18 條件進行篩選，獲得金銀花、連翹各23 個符合條件的有效成分，見表1。46個有效成分對應204個相關靶點。

表1 “銀翹”藥對的有效活性成分

2.2 COVlD-19 相關靶點獲取結果在Gene-Cards 數據庫里檢索“Novel coronavirus pneumonia（新型冠狀病毒肺炎）”，獲得COVID-19相關基因259個。

2.3 “中藥化合物-靶點-疾病”的網絡構建及可視化分析將204 個中藥化合物靶點與259 個COVID-19 靶點基因進行Venn 分析，借助Cytoscape 3.7.2 軟件進行蛋白網絡結構可視化處理，構建“中藥化合物‐靶點-疾病”網絡圖，見圖1。如圖1 所示，獲得藥物‐疾病交集基因44 個，對應“銀翹”藥對有效化合物26個（26個有效成分均參與網絡構建）。在26 個有效化合物中有Quercetin （檞皮素）、luteolin（木犀草素）、Wogonin（漢黃芩素）、kaempferol（山柰酚）、betasitosterol（β-谷甾醇）、beta-carotene （β-胡蘿卜素）、Chryseriol（金圣草黃素）、FORSYTHINOL（連翹苷）、（-）-Phillygenin （連翹脂素）、hyperforin（金絲桃素）、（+）-pinoresinol monomethyl ether（松脂素單甲基醚）等，其中以檞皮素、木犀草素、漢黃芩素、山柰酚、β-谷甾醇為多。見圖2。

圖1 “銀翹”藥對有效成分靶點和COVID-19相關靶點關系的Venn圖

圖2 “化合物-靶點-疾病”可視化網絡圖

2.4 靶蛋白相互作用PPl 網絡分析將44 個藥物-疾病交集靶點通過STRING 數據庫進行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI） 網絡分析，PPI 網絡中有44 個相互作用節點，214 條相互作用連線。根據Count 值篩選列舉出“銀翹”藥治療COVID-19排名前30的關鍵靶點蛋白，見圖1，見圖3—4。

圖3 “銀翹”藥對防治COVID-19相關靶點的PPI網絡

圖4 “銀翹”藥對防治COVID-19的關鍵靶點

2.5 GO 功能分析借助DAVID 6.8 數據庫，對“銀翹”藥防治COVID-19 的44 個靶基因進行GO 富集分析，44個藥物‐疾病交集基因影響了79個生物功能（以P＜0.01為篩選標準）。在79條功能分析條目中，涉及到受體配體活性、轉錄因子活性、細胞因子活性、趨化因子活性、酶活性及生物合成過程的調控等各方面，選取排名前20 位的靶基因功能信息，見圖5，主要富集在細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結合、蛋白磷酸酶結合、生長因子受體結合、G 蛋白偶聯受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合等方面。

圖5 GO 富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路富集分析富集通路發現44 個交集靶點顯著富集在146 條通路上（P＜0.01），包括炎癥、免疫、激素代謝、凋亡、自噬等方面。選取前20 條目，結果顯示，“銀翹”藥物主要影響的通路有：糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、IL-17信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、HIF-1 信號通路、NF-κB信號通路、NOD 樣受體信號通路等經典信號通路。此外還與多種傳染性疾病相關，如甲型流感、丙肝、百日咳、結核、巨細胞病毒感染、EB 病毒感染等相關。見圖6。

圖6 KEGG通路富集

3 討論

許多醫學家認為熱毒疫邪是此次新型冠狀病毒肺炎的主要病因，用溫病學理論指導臨床治療也取得良好效果。“銀翹”藥對即“金銀花-連翹”是治療溫病最常用的藥對之一，二者常常相須為用以增強清熱解毒、疏風散熱之功效。金銀花為忍冬科忍冬屬植物的干燥花蕾，其性甘、寒，氣味芳香，具有清熱解毒、疏散風熱的功效，多用于風熱感冒、溫病發熱、熱毒血痢、喉痹等各種細菌病毒感染，有“中藥青霉素”之稱。連翹為木犀科植物連翹的干燥果實，可清熱解毒、消腫散結、疏散風熱，用于治療風熱感冒、溫病初起、溫熱入營、高熱煩渴、丹毒等。其性甘寒，可清上半身之熱的金銀花配以性苦微寒擅于透達全身之熱的連翹，可在解衛分之熱毒的同時，祛除溫熱病邪常伴隨的穢濁之氣。清代溫病學者吳鞠通擅用金銀花、連翹，其所著《溫病條辨》載方劑204 首，其中金銀花、連翹藥對出現的方劑達26 方，有名的代表方劑為銀翹散［10］。

本研究顯示，“銀翹”藥對中有效化合物為46個，對應的有效成分作用靶點204 個，其中與COVID-19相關共同作用靶點44個。PPI結果顯示其 防 治COVID-19 的 關 鍵 靶 點 為IL-6、IL-1β、MAPK1、MAPK8、CXCL8、RELA、CCL2、IL-10、ICAM1、IL-2、PTGS2、CASP3、MAPK14、STAT1、EGFR、FOS、IL-4等，這些關鍵靶點涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結合、蛋白磷酸酶結合、生長因子受體結合、G 蛋白偶聯受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合等生物學過程。其中“銀翹”藥防治COVID-19 主要有效成分為Quercetin（檞 皮 素）、luteolin（木 犀 草 素）、Wogonin（漢黃芩素）、kaempferol（山柰酚）、betacarotene（β-胡蘿卜素）、Chryseriol（金圣草黃素）、FORSYTHINOL（連翹苷）、（-）-Phillygenin（連翹脂素）、hyperforin（金絲桃素）、（+）-pinoresinol monomethyl ether（松脂素單甲基醚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）等，其中以檞皮素、木犀草素、漢黃芩素、山柰酚為主。研究表明［11］，檞皮素可通過調控TLR4/NF-κB 通路或JAK2/STAT3信號通路，減輕炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的分泌以減輕肺臟炎癥反應。鄧東沅等［12-13］研究表明，木犀草素能調控TLR 通路和凋亡相關因子Caspase-3、Caspase-8 的表達，減輕流感病毒對宿主細胞的免疫損傷，發揮抗病毒作用。漢黃芩素可通過減少巨噬細胞ROS的產生，抑制NF-κB調控的炎癥因子，從而抑制巨噬細胞炎癥反應，亦能抑制流感病毒感染后巨噬細胞內各種炎癥相關因子的產生［14-15］。山柰酚通過阻止NF-κB的活化，從而在mRNA 水平及蛋白水平抑制iNOS、COX-2 及CRP，達到抗炎的目的［16］。山柰酚能有效抑制HepG2 細胞增殖，且在一定的濃度范圍內呈濃度依賴性，山柰酚可以通過抑制自噬誘導HepG2 細胞凋亡。有學者發現，連翹脂素能夠通過誘導TGF-β釋放和IL-10 受體表達來干預巨噬細胞的抗炎功能［17］。LIU 等［18］發現連翹脂素可通過抑制Akt 磷酸化來減少呼吸疾病中炎癥反應并影響葡萄糖代謝。研究表明［19］，連翹苷可通過調控JAK/STAT、PI3K/Akt 通路減輕流感病毒感染的小鼠肺部炎癥細胞的浸潤，降低肺部流感病毒的滴度。

經KEGG 通路分析，“銀翹”藥對防治COVID-19的通路有146 條，主要涉及炎癥、免疫、激素代謝、凋亡、自噬等方面。與COVID-19 緊密相關的通路分別為參與糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、C 型凝集素受體信號通路、HIF-1 信號通路、NF-κB 信號通路、NOD 樣受體信號通路、T 細胞受體信號通路、JAK-STAT 信號通路、VEGF 信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、p53 信號通路、FOXO 信號通路等經典信號通路。此外，“銀翹”藥對還與細胞凋亡、自噬以及多種細菌或病毒感染相關，如對甲型流感、丙肝、百日咳、結核、麻疹病毒、巨細胞病毒、EB 病毒感染等通路進行調控。IL-17 主要有促進炎癥反應的功效，它參與了多種先天性和適應性的免疫應答。DING 等［20］的研究發現，阻斷IL-17 信號通路可以顯著降低膿毒癥誘導的急性肺損傷所致的肺部炎癥反應。HIF-1α是低氧條件下重要的轉錄因子，它可以調節VEGF的轉錄和表達，調控并參與局部組織血管新生的過程。哮喘發作期肺部組織缺氧時，血管平滑肌細胞通過自身細胞的大量增殖并釋放HIF-1α，增強VEGF 的轉錄及蛋白表達，促進局部組織血管新生［21-22］。C型凝集素受體（C-type lectin receptor，CLR）信號通路在天然免疫和繼發免疫中發揮重要作用，尤其是病原微生物的識別與信號傳導、抗原呈遞、介導免疫細胞間相互作用等。研究表明，類屬跨膜蛋白的CLR 通過激活吞噬細胞中的炎癥和抗菌反應直接識別微生物細胞壁并影響先天免疫，對巨噬細胞，樹突狀細胞和嗜中性粒細胞等細胞吞噬作用的激活和調節有重要貢獻［23］。NF-κB的活化可誘導多種促炎因子、趨化因子和抗凋亡蛋白的表達，結核分枝桿菌Hsp70依賴NF-κB信號通路誘導樹突狀細胞表達TNF-α、IL-12p40和IL-6［24］。MAUAD 等［25］通過對H1N1 流感死亡患者肺部組織的病理研究發現死者肺內的TLR3、TNF-α 和IFN-γ 的表達顯著上調，這說明Toll 樣受體信號通路在H1N1 流感發生過程中也起著重要的作用。NOD 樣受體信號通路在細菌入侵時發揮重要作用，當細菌成分入侵時，NOD 樣受體被激活，接著可激活NF-κB通路、MAPK通路，增加促炎因子的釋放。也有研究表明感染流感病毒后，細胞因子IL-1β的產生需要TLR 和NLR 的共同作用與相互協調［26］。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學的方法，對“銀翹”藥對防治COVID-19 的作用機制進行了分析，分析發現“銀翹”藥對是通過多成分、多靶點、多通路來發揮抗病毒、抑菌抗炎、調節免疫作用來防治COVID-19 的作用，為中醫藥配伍治療COVID-19 的研究提供了新方法和新思路。本研究不可避免地存在一些缺陷，如網絡藥理學是基于已有數據庫中的相關數據進行研究，數據搜集的全面性及活性成分篩選標準的制定尚不能做到完全準確，這些需要在今后進一步去驗證。