心肌梗死介入治療后sTRAIL-R2表達(dá)與頸動(dòng)脈斑塊細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的相關(guān)性

陳 芬,李艷萍

陜西省商洛市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西商洛 726000

心血管疾病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因,通常由動(dòng)脈粥樣硬化所致,是發(fā)生心肌梗死等心臟事件的基礎(chǔ)[1-2]。頸動(dòng)脈易損斑塊的破裂和血栓形成是引起心肌梗死、腦梗死等重大心腦血管疾病的主要原因之一[3]。影響斑塊易損性的因素主要包括免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)降解、脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及血管新生等。細(xì)胞凋亡可以通過內(nèi)在的線粒體途徑和外在的死亡受體相關(guān)途徑兩種不同的途徑啟動(dòng)。死亡受體配體——腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)可通過可溶形式的可溶性TRAIL(sTRAIL)釋放,與sTRAIL受體2(sTRAIL-R2)融合,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且已有研究表明,sTRAIL-R2是主要的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)受體之一[4-5]。有研究表明,TRAIL-R2的激活在體外可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而可能有助于易損斑塊表型形成,且sTRAIL-R2水平可預(yù)測普通人群的心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[6]。但關(guān)于此類研究,國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少見。因此,本研究采用頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)標(biāo)本探究斑塊微血管中sTRAIL-R2的表達(dá)水平,并分析其與患者機(jī)體炎癥反應(yīng)和斑塊細(xì)胞相關(guān)性,旨在為此類患者預(yù)后評(píng)估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1樣本來源 選擇2021年1月至2022年5月本院收治的介入治療后行頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)心肌梗死患者102例作為研究對象,其中男53例、女49例,年齡41～72歲,平均(53.27±5.35)歲。所有患者均了解本研究并簽訂知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要試劑 蘇木精-伊紅染色試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,DAPI染色試劑盒購自南京凱根生物科技有限公司,免疫組織化學(xué)試劑盒購自默克生物公司,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 比色測定試劑盒購自上海博爾森生物科技有限公司,山羊抗小鼠β-actin、Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Caspase-3一抗均購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2.2主要儀器 包括細(xì)胞計(jì)數(shù)器(上海上碧實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、Couvter型高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)、DM 750型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、Spectra Max M5型多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)、XDS-3型倒置顯微鏡(青島愛普科生物工程有限公司)、流式細(xì)胞儀(德國Partec公司)、滑動(dòng)式切片機(jī)(北京盛科信德科技有限公司)等。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本獲取及sTRAIL-R2檢測 行頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)后頸動(dòng)脈斑塊立即在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。將獲取樣本切分為長5 mm的片段,對斑塊負(fù)荷最大的片段進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化組織學(xué)檢查。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測每個(gè)片段sTRAIL-R2表達(dá)水平,分為sTRAIL-R2高表達(dá)(>15 pg/mL)組和sTRAIL-R2低表達(dá)(≤15 pg/mL)組。

1.3.2免疫組織化學(xué) 獲取的斑塊組織用10%福爾馬林固定,二甲苯脫蠟2次,梯度乙醇脫水,蒸餾水和磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。然后將組織與1滴過氧化氫孵育10 min,并用PBS洗滌9 min。加入0.01 mol/L 檸檬酸鹽 (pH 6.0) 后進(jìn)行微波抗原修復(fù)20 min。用PBS洗滌9 min后切片與正常山羊血清孵育5 min。去除血清后 4 ℃ 用兔抗CD45、CD68單克隆抗體孵育過夜,然后用PBS洗滌,接著加入山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗,37 ℃孵育30 min,PBS洗滌3次,每次3 min。然后將組織用新制備的二氨基聯(lián)苯胺顯色1～2 min,浸入PBS 3次,每次2 min。隨后將切片用蘇木精復(fù)染1 min。顯微鏡下觀察,計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞所占比例。

1.3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 將獲取的斑塊組織用1 mL組織裂解緩沖液裂解,冰浴且在玻璃研磨機(jī)中研磨成勻漿,4 ℃裂解 30 min,然后4 ℃、300×g 離心20 min取上清液,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β、C反應(yīng)蛋白(CRP)表達(dá)水平。

1.3.4Caspase-3、Caspase-8活性檢測 將獲取的斑塊組織用1 mL組織裂解緩沖液裂解,冰浴且在玻璃研磨機(jī)中研磨成勻漿,4 ℃裂解30 min。將細(xì)胞裂解液300×g離心15 min,上清液保存在冰上進(jìn)行即時(shí)測定。然后將5 mL裂解物加入96孔板中,將Caspase-3、Caspase-8顯色底物5 μL加入每個(gè)孔中,并在37 ℃下孵育1 h。通過Caspase比色測定試劑盒進(jìn)行檢測,在微量滴定板讀數(shù)器上405 nm 處記錄吸光度值。通過比較處理過的細(xì)胞與對照組的結(jié)果確定Caspase-3、Caspase-8活性增加的百分比。

1.3.5蛋白質(zhì)印跡檢測 從斑塊組織中提取總蛋白質(zhì)樣品。斑塊組織用預(yù)冷的組織裂解液勻漿,4 ℃、12 000 r/min 離心15 min取上清液。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)水平。將等水平的蛋白質(zhì)裂解物加載到10%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳上,電泳80 V、30 min和 120 V、60 min,然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h。將膜與Bax、Caspase-3、Bcl-2、β-actin 抗體4 ℃過夜,然后清洗膜并與適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。最后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Clinx Science Instruments,U.S.A.)觀察蛋白質(zhì)條帶。測量 β-actin表達(dá)水平作為內(nèi)源參考并用于標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者斑塊組織sTRAIL-R2表達(dá)水平比較 共獲取297個(gè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜片段。sTRAIL-R2高表達(dá)組150個(gè)片段,sTRAIL-R2低表達(dá)組147個(gè)片段。sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織sTRAIL-R2水平[(19.01±3.24)pg/mL]高于sTRAIL-R2低表達(dá)組[(10.81±4.12)pg/mL],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組患者斑塊組織Caspase-8、Caspase-3活性比較 sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織Caspase-8、Caspase-3活性均高于sTRAIL-R2低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者斑塊組織Caspase-8、Caspase-3活性比較

2.3兩組患者斑塊組織Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均高于sTRAIL-R2低表達(dá)組,Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于sTRAIL-R2低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 兩組患者斑塊組織蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果

表2 兩組患者斑塊組織Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

2.4兩組患者斑塊組織CD45、CD68陽性細(xì)胞檢出數(shù)比較 sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織CD45、CD68陽性細(xì)胞檢出數(shù)均高于sTRAIL-R2低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者斑塊組織CD45、CD68陽性細(xì)胞檢出數(shù)比較個(gè)/mm2)

2.5兩組患者斑塊組織IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平比較 sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平均高于sTRAIL-R2低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者斑塊組織IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平比較

2.6sTRAIL-R2表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平的相關(guān)性 sTRAIL-R2表達(dá)水平與Caspase-8、Caspase-3活性,CD45、CD68、IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平及Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.486、0.401、0.511、0.476、0.510、0.485、0.445、0.518、0.394、0.548、0.559,P<0.05),與Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.681,P<0.05)。見表5。

表5 sTRAIL-R2表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平的相關(guān)性

3 討 論

TRAIL-R2和TRAIL影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展,但關(guān)于其可溶性形式及與人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊生物學(xué)的實(shí)際關(guān)聯(lián)知之甚少。已有體外實(shí)驗(yàn)表明,TRAIL-R2的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7],其中Caspase 激活是細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)相關(guān)的關(guān)鍵途徑之一。Caspase-3(一種效應(yīng)子或執(zhí)行型 Caspase)識(shí)別并分離各種靶蛋白中的短氨基酸序列,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,其作為代表性的執(zhí)行者在細(xì)胞凋亡中起著舉足輕重的作用[8]。Caspase-8可通過分離Bid蛋白從而進(jìn)一步與 Bax結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放,引起細(xì)胞凋亡[9]。此外,Caspase-8還以Caspase前體酶原的形式存在大多數(shù)動(dòng)物的細(xì)胞中,其可在凋亡信號(hào)的作用下首先激活啟動(dòng)型Caspase引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng),通過活化的執(zhí)行型Caspase裂解特異性底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10-11]。Bcl-2 家族由抗凋亡蛋白 Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax組成。Bcl-2是具有代表性的凋亡抑制因子,而Bax可以與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體,拮抗Bcl-2對細(xì)胞凋亡的抑制作用,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12];另一方面Bax還激活Caspase-3,促進(jìn)鈣離子釋放,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。因此,Bax、Bcl-2和Caspase-3被認(rèn)為是評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織Caspase-8、Caspase-3活性均高于sTRAIL-R2低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),證實(shí)sTRAIL-R2水平變化可能引起斑塊細(xì)胞凋亡(活性Caspase-3)和外在死亡受體相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑(活性Caspase-8)表達(dá)水平變化,而相關(guān)性分析進(jìn)一步證實(shí),其水平與Caspase-8、Caspase-3活性呈正相關(guān)(P<0.05),證實(shí)sTRAIL-R2表達(dá)可通過影響患者斑塊細(xì)胞內(nèi)在及外在凋亡途徑影響其細(xì)胞凋亡。此外,本研究sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均高于sTRAIL-R2低表達(dá)組,Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于sTRAIL-R2低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析也顯示,sTRAIL-R2表達(dá)水平與Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05),與Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。證實(shí)sTRAIL-R2高表達(dá)還會(huì)進(jìn)一步調(diào)控患者動(dòng)脈斑塊細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),從而介導(dǎo)患者斑塊細(xì)胞凋亡增加,影響患者病情進(jìn)展。

炎癥反應(yīng)是斑塊發(fā)展和易損性的另一個(gè)關(guān)鍵因素[14]。有研究表明,sTRAIL-R2可通過影響免疫細(xì)胞微血管屏障外滲,對炎癥細(xì)胞浸潤發(fā)揮作用。因此,sTRAIL-R2高表達(dá)可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤增加[15]。而本研究發(fā)現(xiàn),sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織CD45、CD68陽性細(xì)胞檢出數(shù)高于sTRAIL-R2低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且與CD45、CD68水平均呈正相關(guān)(P<0.05),進(jìn)一步證實(shí)sTRAIL-R2高表達(dá)會(huì)引起白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤,加重患者病灶部位炎癥反應(yīng),進(jìn)而引起病情進(jìn)展。同時(shí)本研究還對患者病灶部位炎性細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示,sTRAIL-R2高表達(dá)組患者斑塊組織IL-6、IL-10、CRP水平均高于sTRAIL-R2低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且與IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平均呈正相關(guān)(P<0.05),進(jìn)一步證實(shí)了sTRAIL-R2高表達(dá)加重患者病灶炎癥反應(yīng)的猜想。進(jìn)一步分析sTRAIL-R2高表達(dá)可能引起免疫細(xì)胞浸潤增加,導(dǎo)致患者斑塊易損,誘發(fā)嚴(yán)重心腦血管疾病。由于免疫細(xì)胞浸潤和血管內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞增殖,細(xì)胞數(shù)量的增加產(chǎn)生了對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需求,再加上遠(yuǎn)離外膜層供應(yīng)滋養(yǎng)管的生長,引起斑塊變得缺氧,刺激微血管從外膜生長到含有粥樣斑塊的內(nèi)膜,同時(shí)吸引免疫細(xì)胞,進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)和疾病進(jìn)展[16]。新形成的血管通常不成熟且具有滲漏性,易出現(xiàn)出血等不良事件,導(dǎo)致病變內(nèi)的間質(zhì)壓力增加及被巨噬細(xì)胞吸收的游離膽固醇積累,這些過程增加了斑塊的不穩(wěn)定性并增加了破裂的風(fēng)險(xiǎn)[17]。

本研究不足:(1)本研究作為一個(gè)橫斷面研究,無法進(jìn)一步證實(shí)患者sTRAIL-R2表達(dá)與其斑塊炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的因果關(guān)系,這也是未來研究工作的重點(diǎn)之一;(2)本研究未進(jìn)行細(xì)胞層次實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察sTRAIL-R2表達(dá)對心肌梗死患者介入治療后細(xì)胞凋亡分子層面作用機(jī)制,僅能通過患者最終表達(dá)進(jìn)行分析,深入研究也是下一步工作重點(diǎn),進(jìn)一步研究可通過外在手段對斑塊細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并干預(yù)其sTRAIL-R2表達(dá),觀察其與斑塊細(xì)胞變化的因果關(guān)系;(3)本研究納入樣本較少,且全為本院患者,可能缺乏普遍性,下一步需擴(kuò)大納入樣本進(jìn)行更深層次分析。雖然本研究具有以上不足,但本研究結(jié)果依然具有一定參考價(jià)值,希望在下一步工作中進(jìn)一步完善,為國內(nèi)相關(guān)研究及發(fā)展提供幫助。

綜上所述,sTRAIL-R2高表達(dá)可引起頸動(dòng)脈斑塊細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3活性升高,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平上調(diào)并引起患者斑塊炎癥反應(yīng)加劇,可能導(dǎo)致患者易損斑塊出現(xiàn),對其進(jìn)行靶向干預(yù)可能可穩(wěn)定患者病情。