右美托咪定通過抑制NF-κB及炎癥因子減輕失血性休克大鼠急性肺損傷*

白毅平,江偉哲,李富裕,魏繼承,莫利群△

1.西南醫科大學附屬醫院麻醉科,四川瀘州 646000;2.四川省人民醫院麻醉科,四川成都 610000

急性肺損傷(ALI)是由于各種原因引起肺組織結構發生特征性病理改變而出現的臨床綜合征[1-2]。目前認為,ALI本質是肺內過度性、失控性炎癥反應[3]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是最重要的前炎癥因子[4],可誘導產生炎癥的級聯放大反應;白細胞介素(IL)-6是體內主要的促炎性細胞因子之一,IL-10是體內主要的抗炎性細胞因子之一,有利于重建炎性/抗炎性細胞因子的平衡[5]。核因子κB(NF-κB)是一種蛋白轉錄因子,在炎癥介質的基因轉錄調控中具有重要作用[6]。右美托咪定可減少炎性細胞因子TNF-α、IL-6的表達[7-8],對ALI具有一定的保護作用[9]。同時有研究表明,右美托咪定的器官保護作用可能與激活膽堿能抗炎通路[10]、下調NF-κB表達的抗炎途徑[11]、抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)炎癥通路[12]、直接抑制單核巨噬細胞炎癥因子的表達有關[13]。既往有研究表明,右美托咪定預處理能提高ALI大鼠48 h內生存率,提示其具有肺保護作用,但并未指出右美托咪定明確肺保護作用的有效劑量,且是否通過抑制NF-κB表達而減少炎癥因子而減輕肺損傷。本研究探討了右美托咪定是否通過抑制NF-κB、減少炎癥因子而減輕失血性休克大鼠ALI,現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 健康SD雄性大鼠72只(體質量250～300 g)購于西南醫科大學動物中心,采用隨機數字表法分為對照組(Con組,假手術)、ALI模型組(ALI組)、小劑量右美托咪定組(Dex-0.5組,0.5 μg/kg)、中劑量右美托咪定組(Dex-1.5組,1.5 μg/kg)、大劑量右美托咪定組(Dex-4.5組,4.5 μg/kg)和NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫化氨基甲酸鹽組(PDTC組)。每組12只。

1.2方法

1.2.1模型制備 SD大鼠實驗前12 h禁食,自由飲水;腹腔注射1%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉,四肢固定于動物手術臺上,左側腹股溝備皮消毒,分離股動、靜脈后分別穿刺置管。Con組僅行股動、靜脈穿刺。ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組穿刺后待血壓穩定10 min經股靜脈注入肝素500 U后經股動脈放血,使平均動脈壓(MAP)降至35～45 mm Hg,并通過放血或回輸血液維持MAP在該水平1 h,建立失血性休克所致ALI大鼠模型。Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組于放血前30 min分別經股靜脈給予右美托咪定 0.5、1.5、4.5 μg/kg,10 min泵注完畢。PDTC組于放血前30 min腹腔內注射PDTC 200 mg/kg。模型制備完成后將大鼠放回籠中自由進食、飲水。

1.2.2血氣分析及炎癥因子水平檢測 建模完成后6 h采集股動脈血進行血氣分析,計算氧合指數[動脈血氧分壓(PaO2)/吸入氧氣分數(FiO2)]。斷頸處死大鼠。取左肺,行支氣管插管,生理鹽水1 mL進行支氣管肺泡灌洗,反復灌洗3次后回收支氣管肺泡灌洗液至無菌離心管中,以1 500 r/min離心10 min,收集上清液,置于-70 ℃冰箱保存,采用酶聯免疫吸附試驗檢測灌洗液中IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.2.3肺組織損傷評分及NF-κB表達水平檢測 取右肺上葉測量肺組織濕/干重比(W/D),右肺下葉生理鹽水沖洗后放入10%甲醛固定、石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅染色。鏡檢隨機選擇10個非重疊視野進行肺組織損傷評分,取平均值。評分標準:1分為正常肺組織結構;2分為輕度肺間質充血和中性粒細胞浸潤;3分為血管周圍水腫形成,肺組織結構部分破壞,中度中性粒細胞浸潤;4分為肺組織結構嚴重破壞,大量中性粒細胞浸潤。采用免疫組織化學法觀察肺組織NF-κB表達水平,每張切片隨機選擇5個不重復視野觀察采圖,細胞核或細胞質呈棕黃色為NF-κB免疫組織化學陽性反應,使用專業圖形分析軟件Image Pro Plus 6.0分析圖像,計算每張切片的平均光密度值。

2 結 果

2.1各組大鼠PaO2/FiO2、肺組織損傷評分及W/D比較 與Con組比較,ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠PaO2/FiO2均降低,ALI組、Dex-0.5組大鼠肺損傷評分及W/D均升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與ALI組比較,Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠PaO2/FiO2均升高,Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠肺組織損傷評分及W/D均降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與PDTC組比較,Dex-0.5組大鼠肺組織損傷評分及W/D均升高,PaO2/FiO2降低差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠PaO2/FiO2、肺組織損傷評分及W/D比較

2.2各組大鼠肺組織NF-κB表達水平比較 Con組、ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠肺組織NF-κB表達水平分別為0.078±0.007、0.466±0.008、0.462±0.005、0.246±0.008、0.166±0.003、0.158±0.003。與Con組比較,ALI組大鼠肺組織NF-κB表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與ALI組比較,Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠肺組織NF-κB表達水平均降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與PDTC組比較,ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組大鼠肺組織NF-κB表達水平均升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞因子水平比較 與Con組比較,ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平均升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與ALI組比較,Dex-1.5組、Dex-4.5組大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平均下降,差異均有統計學意義(P<0.05);與PDTC組比較,Dex-0.5組大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平均升高,Dex-1.5組大鼠IL-10、TNF-α水平均升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞因子水平比較

3 討 論

本研究通過建立大鼠失血性休克ALI模型,并采用不同劑量右美托咪定對模型大鼠進行預處理,并加入NF-κB特異性抑制劑(PDTC),觀察了右美托咪定是否通過調節NF-κB及炎癥因子水平減輕失血性休克大鼠ALI。大鼠失血性休克模型采用建模更穩定的定壓型模型[14]。本研究結果顯示,ALI組比Con組大鼠PaO2/FiO2降低,肺組織損傷評分及W/D升高,表明ALI模型建立成功。

既往雖有研究表明右美托咪定預處理能提高ALI大鼠48 h內生存率,提示其具有肺保護作用[15],但并未指出右美托咪定明確肺保護作用的有效劑量。本研究結果顯示,ALI建模前30 min靜脈給予低劑量(0.5 μg/kg)右美托咪定,雖然PaO2/FiO2比ALI組有所改善,但肺組織損傷評分及W/D無改善,肺組織水腫仍然明顯、肺損傷嚴重。然而使用中等劑量(1.5 μg/kg)和大劑量(4.5 μg/kg)右美托咪定預處理后不僅PaO2/FiO2比ALI組有所改善,而且肺組織損傷評分及W/D均降低,肺組織水腫及肺組織損傷明顯減輕,提示1.5、4.5 μg/kg右美托咪定能有效減輕肺組織損傷,具有肺保護作用,與ZHANG等[9]研究結果一致。本研究使用低劑量(0.5 μg/kg)右美托咪定預處理ALI模型后肺組織損傷評分及W/D均無明顯改善,但PaO2/FiO2有所改善,說明0.5 μg/kg右美托咪定對ALI模型肺功能的改善還是有益的,而1.5、4.5 μg/kg右美托咪定減輕ALI效果更明顯。

NF-κB表達與炎癥因子及肺損傷存在明顯相關性。本研究ALI組大鼠建模后肺組織NF-κB表達水平明顯升高,肺泡灌洗液中促炎性細胞因子IL-6、TNF-α水平也明顯升高。ALI大鼠建模前使用NF-κB特異性抑制劑PDTC后肺組織NF-κB表達水平明顯降低,肺泡灌洗液中促炎性細胞因子IL-6、IL-10、TNF-α水平也明顯降低;并且肺組織損傷評分及W/D均降低,PaO2/FiO2升高。既往研究表明,NF-κB活化在引發肺內炎癥反應及肺損傷病理過程中起重要作用,并且抑制NF-κB 的激活可減輕肺損傷[16-17]。

本研究進一步探討了1.5、4.5 μg/kg右美托咪定預處理對NF-κB表達、炎癥因子及減輕肺損傷的作用,結果顯示,1.5、4.5 μg/kg右美托咪定預處理能有效抑制肺組織NF-κB的激活,IL-6、IL-10、TNF-α水平均降低,肺組織損傷評分及W/D也均降低,并存在劑量相關性,0.5 μg/kg右美托咪定預處理效果不明顯。有研究發現,大劑量右美托咪定才可通過激動α2-腎上腺能受體并調節細胞Toll樣受體4/NF-κB/MAPKs通路,減少巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10[12]。本研究進一步驗證了4.5 μg/kg右美托咪定通過抑制NF-κB及炎癥因子水平在大鼠失血性休克ALI模型中的肺保護作用機制。在脂多糖ALI動物模型中也觀察到1.5、4.5 μg/kg右美托咪定能明顯降低大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎癥細胞因子水平[9-10]。另外右美托咪定腹腔內注射及持續泵注也顯示了明顯的NF-κB活性抑制作用[18-19],其機制可能與右美托咪定抑制鈣離子的內流相關[20-21]或通過抑制炎癥反應鏈的正反饋作用,間接抑制NF-κB激活[20-21]。

綜上所述,1.5、4.5 μg/kg右美托咪定預處理可減輕失血性休克大鼠ALI,其可能與抑制NF-κB活化及炎癥因子水平的表達相關。