外周血凝血指標、MTHFR和MTRR基因多態(tài)性在易栓癥反復自然流產(chǎn)中的診斷價值

高翔,朱云霞,孟君,張雙霞,熊霞鸝,張志紅,馬曉鵬,王金花

(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院產(chǎn)科,北京 100069)

易栓癥孕婦胎盤內(nèi)凝血和纖溶平衡狀態(tài)的失調(diào),及絨毛微小血管和子宮螺旋動脈病變率的增加,會提高胎盤血栓和梗阻的風險,導致反復自然流產(chǎn)[1-2]。葉酸為B族維生素,參與DNA甲基化、合成及其它重要代謝反應,因而孕婦體內(nèi)葉酸的代謝失調(diào)是導致反復流產(chǎn)的原因之一[3-4]。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是兩種重要的葉酸代謝酶,它們能夠調(diào)節(jié)機體中維生素B9和B12的表達,維持體內(nèi)同型半胱氨酸水平,防止高凝狀態(tài)的發(fā)生[5]。缺乏葉酸和維生素B12的孕婦,體內(nèi)同型半胱氨酸過多,損傷血管內(nèi)皮功能,促進血管平滑肌細胞增殖,最終造成高凝狀態(tài)。本研究旨在探討外周血凝血指標水平、MTHFR和MTRR基因多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年3月至2022年11月首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院收治的98例反復自然流產(chǎn)患者(流產(chǎn)次數(shù)≥2次)的非妊娠婦女為研究對象;另選取同時期行孕前檢查的健康非妊娠婦女80名作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。納入標準:(1)觀察組婦女連續(xù)自然流產(chǎn)次數(shù)≥2次,且其生殖系統(tǒng)解剖學正常,確診為易栓癥[6];(2)患者的認知正常,可配合相關(guān)檢查;(3)患者自愿參與此次研究,并簽署知情同意書。排除標準:(1)合并有甲狀腺疾病、心腦血管疾病、自身免疫性疾病或血栓類疾病者;(2)不明原因自然流產(chǎn)者;(3)患者有吸煙、酗酒等嗜好;(4)入組前服用過抗凝藥物者。

1.2 方法

(1)根據(jù)患者的就診資料,整理記錄每位患者的年齡、民族、居住地、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、人工助孕史。(2)采集所有入選者的晨起外周靜脈血3 mL,置于抗凝試管中保存。后采用全自動血細胞分析儀檢測D-二聚體(D-D)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)及凝血活酶時間(aPTT)。(3)采用熒光定量PCR技術(shù),檢測MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymor-phism,SNP)分型。每個反應體系10 μL,包含2×Taqman Universal Master Mix 5 μL、DNA模板1 μL、去離子水3.5 μL和20×Taqman-MGB探針0.5 μL,進行PCR擴增,通過熒光定量PCR儀讀取終點熒光,確定樣本基因分型結(jié)果。其中MTHFR C677T基因位點引物:F序列為AAGCTGCGTGATGATGAAATCG,R序列為CTCCCGCAGACACCTTCTCC。MTHFR A1298C基因位點引物:F序列為AACGAAGACTTCAAAGACACTT,R序列為CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCC。MTRR A66G引物:F序列GGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT,R序列TGTGAGCAAGCTGTGGTACAT。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩組對象一般資料比較

兩組對象年齡、民族、BMI、居住地及人工助孕史比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組對象一般資料比較

2.2 兩組對象血清凝血指標、MTHFR和MTRR基因多態(tài)性比較

兩組對象外周血凝血指標PT、TT、aPTT比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),觀察組血漿D-D高于對照組(P<0.05)。Hardy-Weinberg平衡定律檢驗結(jié)果顯示,入組婦女的三種基因多態(tài)性都符合遺傳平衡。觀察組人群的MTHFR A1298C、MTHFR C677T及MTRR A66G的χ2值為1.667、3.294、3.248(P>0.05);對照組基因型的χ2值分別為1.563、0.061、1.098(P>0.05)。兩組MTHFR A1298C、MTRR A66G的基因型比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05),而觀察組MTHFR C677T的TT型基因及等位基因T表達高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組對象血清凝血指標、MTHFR和MTRR基因多態(tài)性比較

2.3 血漿D-D、MTHFR C677T基因型與易栓癥自然流產(chǎn)的Logistic回歸分析

血漿D-D高表達、MTHFR C677T基因型TT是易栓癥反復自然流產(chǎn)(易栓癥反復自然流產(chǎn)=1,健康=0)的獨立危險因素(P<0.05)。見表3及表4。

表3 多因素Logistic回歸分析的變量賦值表

表4 易栓癥自然流產(chǎn)發(fā)生影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

引起反復自然流產(chǎn)的因素多樣,而易栓癥是其重要原因之一[7]。易栓癥可分為獲得性和遺傳性兩大類,遺傳性易栓癥流產(chǎn)是由產(chǎn)婦凝血基因突變或凝血基因缺陷而導致的胎盤微循環(huán)障礙引起,而獲得性則是因為高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血癥和磷脂抗體的存在[8]。外周血凝血指標可直接反應產(chǎn)婦的凝血功能[9],同時MTHFR和MTRR基因的SNP分型與葉酸代謝有關(guān)[10-11],或可協(xié)助預估易栓癥性反復自然流產(chǎn)發(fā)生風險。

本研究表明,兩組外周血PT、aPTT、TT無差異,但血漿D-D水平在反復流產(chǎn)患者中有升高。有關(guān)研究[12]表明,血漿D-D升高可能是復發(fā)流產(chǎn)的危險因素之一,可能是由于血小板在受到內(nèi)源或外源性刺激物作用下被激活,導致缺血或血栓,影響血液循環(huán)。血漿D-D水平升高是血栓形成和高凝狀態(tài)的重要指標[13],它通過纖維蛋白原凝血酶轉(zhuǎn)變成交聯(lián)纖維蛋白單體,再由活化因子XⅢ作用形成交聯(lián)纖維蛋白,最后被纖維酶水解產(chǎn)生[14-15],因此,它的升高可能暗示身體存在明顯的繼發(fā)性纖溶過程。因此本研究認為,監(jiān)測血漿D-D的表達有利于易栓癥反復自然流產(chǎn)的早期診斷。

MTRR和MTHFR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶,而其位點基因突變會導致酶活性降低。本研究通過使用熒光定量PCR技術(shù)檢測MTHFR基因C677T、A1298C位點及MTRR基因A66G位點的SNP分型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩組MTHFR A1298C、MTRR A66G基因型并無差異,但兩組的MTHFR C677T基因多態(tài)性存在統(tǒng)計學差異。在觀察組中,MTHFR C677T位點TT基因型、等位基因T占比為28.57%和48.98%,分別均高于對照組的占比12.50%和36.25%,前者較高。這可能是因為MTHFR C677T位點C被T取代后,編碼的丙氨酸被纈氨酸代替,從而導致酶的耐熱性和活性下降,導致血漿中Hcy的異常表達。在潘銀平等[16]的研究中也認為MTHFR C677T中的TT基因型會增加不良妊娠風險,本研究結(jié)果與其一致。也有研究[17]表明,MTRR、MTHFR基因型均可影響妊娠結(jié)局,MTHFR C677T與A1298C協(xié)同作用也能導致酶活性減弱,使得Hcy濃度增加,引發(fā)流產(chǎn)及出生缺陷。在國外學者研究[18]中,MTRR、MTHFR基因多態(tài)性被證實還可影響唐氏綜合征等多種疾病的發(fā)生風險。可見,MTHFR和MTRR基因的多態(tài)性可能導致葉酸代謝的異常,從而引發(fā)不同的疾病。因此,通過檢測MTHFR基因C677T、A1298C位點和MTRR基因A66G位點的SNP分型,可以幫助臨床醫(yī)生進行更有針對性的疾病干預,有效地改善母嬰結(jié)局。本研究還顯示,Logistic分析表明MTHFR C677T位點TT基因型及血漿D-D均為易栓癥反復自然流產(chǎn)發(fā)生的影響因素,可協(xié)助臨床評估妊娠風險。

綜上,MTHFR基因多態(tài)性、外周血D-D表達影響易栓癥反復自然流產(chǎn)的發(fā)生,而MTRR基因型影響并無差異。但需要注意的是,易栓癥流產(chǎn)是受多種因素影響的綜合結(jié)果,由于條件限制,本研究的入選樣本數(shù)量較少,因此研究結(jié)果可能存在一定的誤差。未能控制其他變量也是本研究的另一個限制。在今后的研究中,會進一步擴大樣本量,完善研究方案,提高結(jié)果的科學性。