EGCG通過調節GLUT4移位改善2型糖尿病大鼠海馬胰島素抵抗

唐釩,劉華,呂寅春,佘光鵬,鐘林芮,鄒金池,方禮琴,買文麗

(川北醫學院,1.基礎醫學與法醫學院;2.臨床醫學系;3.麻醉學系;4.眼視光醫學院,四川 南充 637000)

作為慢性代謝性疾病,2型糖尿病隨著病程進展,可造成中樞神經系統損傷[1]。大腦是胰島素敏感器官,長期高血糖刺激使得腦內胰島素敏感性降低,發生胰島素抵抗,最終發展成糖尿病腦病,海馬作為大腦重要組成部分,參與學習記憶、情緒和突觸可塑性過程。海馬胰島素抵抗導致大腦結構和功能受到不同程度損傷[2-3]。胞漿內總葡萄糖轉運體4(total glucose transporter 4,T-GLUT4)在胰島素的調節下,移位到細胞膜,細胞膜上的GLUT4(plasma membrane glucose transporter 4,PM-GLUT4)才能使葡萄糖被有效地攝入細胞內。GLUT4移位和膜上GLUT4含量變化與胰島素抵抗發生關系密切[4]。2型糖尿病大鼠在誘導出胰島素抵抗前,其骨骼肌細胞的GLUT4的轉位水平已經降低,產生胰島素抵抗后,胰島素受體活化障礙,胰島素受體無法被激活,轉位至細胞膜的GLUT4減少,導致血糖升高,細胞攝取葡萄糖減少,因此GLUT4轉位是細胞攝取葡萄糖的關鍵[5],既往研究[6-9]已證實GLUT4在大腦皮質和海馬中也有表達,是海馬胰島素抵抗的中心角色[10]。因此,研究糖尿病腦病患者海馬區GLUT4移位改變,對海馬胰島素抵抗的治療至關重要。作為綠茶的主要成分,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功效[11],可通過增加骨骼肌胞漿內GLUT4移位增加葡萄糖的攝取[12],降低胰島素抵抗。但目前尚未見EGCG對海馬區GLUT4移位的研究。本研究擬探討EGCG通過調節海馬GLUT4移位從而實現改善胰島素抵抗和保護海馬神經元作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡清潔級雄性健康SD大鼠60只,體重(200±20)g,合格證號:SOXK(川)2018-076,安置于SPF動物房,自由攝食,23～27 ℃,通風良好。所有動物實驗操作均遵守國際實驗動物倫理學要求。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 藥物 鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,Solarbio公司);EGCG(上海源葉生物科技有限公司),高脂飼料D12492 (Research Diets公司)。

1.2.2 主要試劑 改良Lillie-Mayer蘇木素染液、伊紅染液(G1100)購自北京索萊寶科技有限公司;血糖試紙(三諾有限公司);糖化血紅蛋白試劑盒(南京建成生物研究所);胰島素試劑盒(南京建成生物研究所);GLUT4(Protentech公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型建立 動物隨機分組后適應性飼養1周后高脂飼料飼養1個月,空腹12 h后給腹腔注射枸櫞酸緩沖液(pH=4.5)配制的1% STZ 25 mg/kg,正常組大鼠腹腔注射枸櫞酸緩沖液各組繼續同前飼養4周后采尾靜脈血測定空腹血糖(FBG)、空腹血清胰島素(FINS),并計算胰島素敏感指數(HOMA-IR),以FBG≥11.1 mmol/L作為2型糖尿病模型判斷標準。造模完成后開始給藥,SD大鼠分為5組:正常組(con組)、糖尿病組(m組)、二甲雙胍組(met組)、EGCG低劑量組(EL組)、EGCG高劑量組(EH組),每組各10只。met組給予二甲雙胍 200 mg/kg;EL組給予EGCG 50 mg/kg;EH組給予 100 mg/kg,con組及m組灌服生理鹽水0.1 mL/kg,各組大鼠均灌胃8周。給藥期間定期檢測動物FBG、FINS水平及體重變化。

1.3.2 Morris水迷宮實驗 給藥結束后,進行水迷宮測試,連續測試5 d(繼續給藥),固定Morris水迷宮平臺位置,平臺沒于白色水下2 cm,水溫(25±1)℃。測試第一階段,定位航行試驗,訓練5 d,每天上、下午各訓練1次,每天入水象限不同。每次入水將大鼠于象限邊緣中點頭朝池壁放入水中,記錄尋找平臺所需時間(逃避潛伏期),>2 min尋臺失敗,引導大鼠上臺,休息1 min。測試第二階段,空間探索試驗,撤去平臺,選擇非原平臺所在象限為入水點,記錄2 min內大鼠跨越原平臺所在位置的次數。

1.3.3 動物取材 Morris水迷宮實驗結束后,3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,心臟采血,取血清,-20 ℃保存備用。每組隨機選取5只大鼠,分離海馬,凍存于-80 ℃的冰箱中待檢測。每組其余5只大鼠腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中待測。

1.3.4 血糖、胰島素檢測 按三諾血糖儀要求檢測大鼠血糖,并按試劑盒步驟完成胰島素酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測。

1.3.5 糖化血紅蛋白檢測 按步驟對大鼠心臟采血2 mL,肝素抗凝,1 500 G離心30 min,取紅細胞,按說明書步驟進行比色法檢測。

1.3.6 海馬組織形態觀察 取5 μm的石蠟組織切片,進行蘇木精-伊紅染色法(HE)染色。

1.3.7 免疫組織化學GLUT4表達的檢測 每組制備5 μm的數張,于37 ℃過夜,二甲苯脫蠟,逐級乙醇脫水,在常溫下用30%過氧化氫封閉,以除去內源性過氧化氫酶影響,隨后用檸檬酸鈉緩沖液于沸騰狀態下修復抗原20 min,冷卻至常溫后加入一抗(GLUT4,1∶200),4 ℃孵育過夜,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次后加入二抗,通過鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(streptavidin-biotin complex, SABC)擴增,3′-3-二氨基聯苯胺(DAB)顯色,并用蘇木精復染,最后梯度乙醇和二甲苯脫水透明后用中性樹脂封片,鏡下觀察并拍照。

1.3.8 Western blot法檢測海馬組織GLUT4的表達 將剝離的海馬組織在冰上研磨,使用胞膜與胞漿蛋白提取試劑盒,參照使用說明對膜蛋白進行提取,喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。10%酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后,5% 奶粉封閉 1 h,分別加入兔源性多克隆抗體GLUT4(1∶500),4 ℃ 搖床孵育過夜,含Tween -20的Tris鹽緩沖液(TBST)洗滌3次(5 min),加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶10 000)搖床上孵育 1 h,TBST 洗滌3次(5 min),化學發光法顯影,在Fusion Fx5 Spectra系統進行曝光,用ImageJ軟件進行灰度分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 EGCG干預前各組大鼠體重、FBG、FINS及HOMA-IR比較

與con組比較,m組、met組、EL組及EH組大鼠體重、FBG、FINS、及HOMA-IR均升高(P<0.05);除con組外,其余各組大鼠以上指標組間比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 EGCG干預前各組大鼠體重、FBG、FINS和HOMA-IR比較

2.2 EGCG干預后各組大鼠體重、FBG、FINS及HOMA-IR比較

與con組相比,m組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR上升(P<0.05),體重下降(P<0.05);與m組相比,met組、EL組及EH組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR下降(P<0.05),EL組及EH組體重均上升(P<0.05);與EL組相比,EH組體重上升(P<0.05),FINS下降(P<0.05);met組、EL組及EH組大鼠FBG及HOMA-IR比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 EGCG干預后各組大鼠體重、FBG、FINS和HOMA-IR比較

2.3 EGCG治療后各組大鼠糖化血紅蛋白比較

與con組比較,m組大鼠糖化血紅蛋白升高(P<0.05);與m組比較,met組、EL組及EH組大鼠糖化血紅蛋白均降低(P<0.05);met組、EL組及EH組組間糖化血紅蛋白比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.4 EGCG對糖尿病大鼠空間學習記憶的影響

與con組比較,m組大鼠平均逃避潛伏期延長、穿臺次數減少(P<0.05);與m組比較,met組及EH組大鼠平均逃避潛伏期縮短、穿臺次數增加(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠Morris 水迷宮實驗尋臺時間和穿臺次數

2.5 EGCG對海馬CA1區形態影響

con組大鼠海馬錐體細胞胞體飽滿,胞核大而圓,胞質豐富;而m組大鼠海馬錐體細胞胞膜褶皺,胞核皺縮,胞質減少,細胞數量減少;met組及EH組大鼠胞質較m組豐富,胞膜完整,胞體大和細胞結構清晰,EH組錐體細胞數量較met組減少。EL組大鼠錐體細胞也出現部分細胞體積減小,核固縮。見圖2。

2.6 EGCG對大鼠海馬CA1區GLUT4表達的影響

與m組比較,con組大鼠海馬組織CA1區錐體細胞膜上棕色顆粒PM-GLUT4減少,與m組比較,met組、EL組及EH組海馬組織CA1區錐體細胞膜上棕色顆粒PM-GLUT4增加,與EL組比較,EH組錐體細胞膜上棕色顆粒PM-GLUT4增加。見圖3。

2.7 EGCG對大鼠海馬GLUT4移位表達的影響

與con組比較,m組大鼠海馬PM-GLUT4的蛋白表達水平降低(P<0.05);與m組比較,met組及EH組大鼠PM-GLIUT4蛋白表達水平增加(P<0.05)。各組大鼠海馬T-GLUT4蛋白表達水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。與con組比較,m組大鼠海馬PM-GLIUT4/ T-GLUT4比值降低(P<0.05);與m組比較,met組及EH組大鼠海馬PM-GLIUT4/ T-GLUT4比率增高(P<0.05)。見圖4。

3 討論

糖尿病腦病(diabetic encephalopathy,DE)是一種與糖尿病相關的中樞神經系統并發癥,以認知行為缺陷為特點。學習記憶是認知功能的重要組成部分[13]。海馬作為學習和記憶的重要腦區,對能量代謝尤為敏感,糖尿病腦病發生時,海馬區的胰島素抵抗使海馬發生代謝紊亂,從而損害認知[14-15]。本研究通過小劑量STZ+高脂飼料成功制備2型糖尿病大鼠模型。Morris水迷宮實驗結果顯示,模型組大鼠逃避潛伏期延長、穿臺次數減少,海馬HE染色可見神經細胞胞膜褶皺,胞核皺縮,胞質減少,表明2型糖尿病導致大鼠海馬結構和功能損傷。

葡萄糖轉運蛋白(glucose transporters,GLUTs)包括十多個蛋白質家族。GLUT4作為胰島素敏感蛋白,廣泛存在與外周組織如骨骼肌、心肌和脂肪組織中,在糖尿病時,其表達和轉運將會下降,從而導致體內高血糖[16-17]。在中樞神經系統中,GLUT4也存在于海馬中,同樣發揮轉運葡萄糖供給錐體細胞能源作用,當受到高糖等刺激時,位于其上游的信號轉導通路激活,促使GLUT4從胞質中轉運至胞膜上發揮作用[18]。本研究顯示,2型糖尿病大鼠海馬PM-GLUT4明顯減少,免疫組織化學結果顯示模型組海馬神經細胞膜上GLUT4染色顯著降低,表明GLUT4易位受損是海馬胰島素抵抗所致認知和代謝損傷的關鍵因素與McNay等[10]研究結論基本一致。

含有白藜蘆醇、阿魏酸和EGCG的配方奶粉能改善胰島素抵抗,增強了肌肉細胞GLUT4向質膜的移位[19],且EGCG可通過PI3K/AMPK促進骨骼肌GLUT4的移位[12],而EGCG的代謝產物通過血腦屏障進入中樞發揮作用[20],改善糖尿病所導致的認知障礙[21],與本研究中Morris水迷宮結果類似。此外,本研究的免疫組織化學染色和WB顯示EL和EH組大鼠海馬PM-GLUT4增加,證明EGCG確實可以通過調節海馬神經元GLUT4移位,改善胰島素抵抗對海馬結構和功能的損傷。盡管本研究EL組海馬組織結構雖損傷不明顯,但Morris實驗和WB實驗結果顯示,由于EL組PM-GLUT4含量降低,大鼠學習記憶能力下降,說明EGCG治療作用具有劑量依賴性,高劑量治療效果優于低劑量。但本研究還存在一定的局限性,關于EGCG增加海馬GLUT4移位的分子機制尚未普及,后續仍需進一步完善。

綜上,EGCG通過增加海馬神經元GLUT4移位,有效改善中樞胰島素抵抗,減少海馬結構損傷,提高2型糖尿病大鼠學習記憶能力,并呈現劑量依賴性。