復合蛋白肽對高脂飲食誘導肥胖大鼠糖脂代謝的影響

趙慧文 王淑娥 張釗 張學軍 張西平 魏瑋 趙秀蘭

摘 要：目的：探究復合蛋白肽對高脂飲食誘導肥胖大鼠糖脂代謝的改善作用。方法：將雄性SD大鼠隨機分為肥胖模型組、空白對照組，肥胖模型組給予高脂飼料持續喂養4w，篩選肥胖敏感大鼠分為低（LPP）、中（MPP）、高（HPP）劑量組，飼料中復合蛋白肽的含量分別為25%、50%、100%，另設與低、中劑量組等熱量飼喂的模型對照組1（MC1）和高劑量組等熱量的模型對照組2（MC2）。給予復合蛋白肽干預4w后，檢測各組大鼠體重與脂肪含量、肝臟脂肪蓄積以及棕色脂肪能量代謝相關蛋白情況。結果：復合蛋白肽能夠顯著降低肥胖大鼠的體重、脂肪含量及血脂水平，同時能夠降低肝臟脂滴密度，增加線粒體氧化磷酸化復合物（OXPHOS）、解偶聯蛋白1（UCP1）表達水平。結論：復合蛋白肽能降低肥胖大鼠體內脂肪含量和血脂水平，可能與增強棕色脂肪組織中OXPHOS和UCP1表達相關。

關鍵詞：復合蛋白肽；高脂飲食；肥胖；糖脂代謝

人群研究證實，高蛋白攝入可以減重、改善體脂指數、改善脂代謝及肥胖引起的慢性炎癥，還能夠降低心血管疾病的發病風險[1-9]。動物研究顯示，高蛋白飲食可以降低體重和體脂，以及降低肝臟甘油三酯含量并提高胰島素敏感性[10-11]。本研究首先采用高脂飼料誘導大鼠肥胖，然后用添加不同比例的復合蛋白肽樣品喂飼動物，并觀察了對動物體重、糖代謝及脂肪代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

復合蛋白肽，由中食都慶（山東）生物技術有限公司提供；抗解偶聯蛋白1（UCP1）抗體、抗線粒體氧化磷酸化復合物（OXPHOS）抗體，美國Abcam公司；β-actin抗體，美國Sigma-Aldrich公司；HRP標記二抗，北京中山金橋生物技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，美國Pierce Biotechnology；發光試劑ECL，美國Millipore公司；油紅O，美國Sigma-Aldrich公司。主要儀器：AU5800全自動生化分析儀，美國Beckman Coulter公司；低溫高速離心機，德國Heraeus Biofuge Stratos公司；MICROMHM525冰凍切片機、天能5200 multi全自動化學發光圖像處理系統，德國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 健康SPF級SD雄性大鼠，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。實驗動物生產許可證號為SCXK（魯）20190003。實驗動物使用許可證號為SYXK（魯）20150015。飼養環境為SPF級環境溫度（24±2）℃，相對濕度（50±10）%，明/暗循環為12 h/12 h。大鼠適應性喂養5 d后，隨機分為喂飼高脂飼料的肥胖模型組和空白對照組，2組飼料脂肪供熱比分別為45%和10%，持續喂養4 w至2組動物體重出現統計學差異（P＜0.05）。篩選肥胖敏感大鼠分為低、中、高劑量組，其中低、中劑量組飼料在50%高脂飼料基礎上分別添加25%、50%的復合蛋白肽，高劑量組飼料由100%的復合蛋白肽制成，另設與低、中劑量組等熱量飼喂的模型對照組1和高劑量組等熱量的模型對照組2。模型對照組1飼料由50%高熱量飼料和50%維持飼料組成，模型對照組2喂飼維持飼料。原空白對照組喂飼維持飼料，飼料配方如表1所示、復合蛋白肽樣品成分如表2所示。實驗期間動物自由飲水，定期稱重和記錄飼料消耗。實驗結束后，動物空腹16 h，稱量空腹體重，然后用10%水合氯醛和20%烏拉坦混合麻醉劑（1∶1）（0.5 mL/100 g BW）麻醉大鼠。腹主動脈取血，解剖動物取臟器及脂肪稱重。血液4 ℃、1 000 g離心20 min，取血清全自動生化分析儀檢測血脂及生化指標。

1.2.2 肝臟油紅O染色 取肝左葉相同部位制備10 μm冰凍切片，預冷10%福爾馬林溶液固定，蒸餾水洗滌，丙二醇浸泡5 min除去多余水分，60 ℃油紅O染色10 min，85%丙二醇溶液分化，蒸餾水漂洗，蘇木素中浸染30 s，流水沖洗后甘油明膠封片，顯微鏡下觀察、采集圖片。

1.2.3 血脂及血生化指標檢測 全自動生化分析儀檢測小鼠血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.2.4 Western blot檢測 采用RIPA裂解液和電動勻漿器制備棕色脂肪組織勻漿，冰上靜置30 min，4 ℃、12 000 g離心15 min取上清液，BCA檢測蛋白質含量。蛋白質變性，SDS-PAGE分離目的蛋白，轉印至PVDF膜，3%脫脂奶粉TBST室溫下封閉1 h，加入一抗4 ℃搖床過夜，洗膜后置于辣根過氧化物酶標記二抗中室溫孵育1 h，采用天能5200 multi全自動化學發光圖像處理系統顯示目的條帶，ImageJ軟件分析條帶。

1.3 數據處理

采用SPSS 24.0進行數據處理，數值變量資料以x±s表示。各組別采用ANOVA進行方差分析，兩兩比較，若方差齊選用LSD法，方差不齊選用Dunnett's T3法。處理結果中，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 各組大鼠體重及總熱能攝入情況

由表3可見，干預實驗期間各組大鼠體重均呈增長趨勢。除高劑量組外，各組動物各時點體重均明顯高于空白對照組（P＜0.05、P＜0.01），中、高劑量組動物增重明顯低于模型對照組1（P＜0.01）；高劑量組動物增重明顯低于模型對照組2（P＜0.01）。由表4可見，高劑量組和模型對照組2動物熱能攝入量明顯低于其他各組（P＜0.01），高劑量組明顯低于模型對照組2（P＜0.01）；其余各組總熱量攝入無明顯差別。結果顯示，復合蛋白肽能夠降低肥胖動物體重，且能夠明顯降低總熱量攝入。

2.2 各組動物體內脂肪和肝臟脂肪含量變化

由表5可見，低、中劑量組動物內臟脂肪（腎周、附睪）重量低于模型對照組1，高劑量組動物內臟脂肪明顯低于模型對照組2（P＜0.01）；低、中劑量組動物白色脂肪（腎周、附睪、皮下）低于模型對照組1，高劑量組動物白色脂肪低于模型對照組1（P＜0.01）和模型對照組2（P＜0.05）。結果顯示，復合蛋白肽能夠減低肥胖大鼠的內臟脂肪和白色脂肪。

圖1大鼠肝臟冰凍切片油紅O染色顯示，空白對照組肝臟中脂滴較少，模型對照組2的脂滴數量和密度均明顯增多，低、中劑量組的肝臟脂滴數量和密度較模型對照組1均有所下降，高劑量組的脂滴染色與模型對照組1和組2相比均明顯減少。結果顯示，復合蛋白肽可降低肥胖動物肝臟脂肪含量。

2.3 各組動物血脂及糖代謝指標變化

由表6看出，與模型對照組1相比，低、中、高劑量組動物血清TG、總膽固醇和LDL-C均呈現不同程度的降低，其中高劑量組TG和總膽固醇低于空白對照組（P＜0.05）。各組間HDL-C變化不明顯。由圖2可見，各劑量組GTT各時間點葡萄糖水平和AUC與模型組相比，差異不大；由圖3可見，各劑量組ITT各時間點血糖和AUC與模型對照組略有降低，但均無顯著性差異（P＞0.05）。結果顯示，復合蛋白肽能在一定程度上降低血脂水平。

2.4 各組動物棕色脂肪組織線粒體能量代謝相關蛋白表達改變

由圖4和圖5看出，低、中、高劑量組大鼠棕色脂肪OXPHOS的整體表達高于模型對照組，中、高劑量組升高具有統計學意義（P＜0.05）。與模型對照組1相比，低、中劑量組中復合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的表達水平升高有統計學差異（P＜0.01、P＜0.05）；與模型對照組2相比，高劑量組的復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的表達升高具有統計學意義（P＜0.01）。低、中、高劑量組動物棕色脂肪中的UCP1表達也呈現出升高趨勢。

3 討論

對包括24項隨機對照試驗的薈萃分析顯示，高蛋白飲食能夠明顯減低人體體重、脂肪含量和血甘油三酯水平，伴隨去脂組織和靜息能量消耗增加[12]。膳食脂肪供能同為30%的情況下，攝食蛋白質供能25%的高蛋白與攝食蛋白質供能12%的受試者相比，6個月后平均減重3.7 kg，其中平均減低脂肪重量3.3 kg[13]。研究顯示，高蛋白飲食可以刺激胰高血糖素樣肽-1、膽囊收縮素和酪酪肽分泌，這些多肽激素可以通過刺激迷走神經，增加飽腹感，從而減少食物攝入[14]。本研究觀察到，添加25%和50%復合蛋白肽的實驗動物攝食無明顯降低，但全部攝食復合蛋白肽的實驗動物飼料消耗量和能量攝入明顯低于對照動物。

研究顯示，高蛋白飲食降低體重的作用也與增加脂肪氧化和能量消耗相關[15-16]。脂肪組織分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織，其中白色脂肪組織以甘油三酯的形式儲存能量，而棕色脂肪組織含有大量的線粒體。動物研究顯示，通過氧化磷酸化刺激線粒體的生物合成、產熱及能量消耗可控制小鼠肥胖[17]。線粒體氧化磷酸化電子傳遞鏈系統包含位于線粒體內膜中的5個呼吸鏈酶復合物（CⅠ-NDUF88、CⅡ-SDHB、CⅣ-MTCO1、CⅢ-UQCRC2、CⅤ-ATP5A），以ATP的形式釋放能量，是細胞能量供給的主要方式。動物和人群試驗均顯示，高脂飲食導致的肥胖和胰島素抵抗可導致OXPHOS和線粒體合成的基因減少，反之，OXPHOS系統的功能障礙也可引起線粒體呼吸鏈復合物的形成和脂質代謝紊亂，從而導致肥胖和2型糖尿病的發生[18-19]。研究證實，棕色脂肪可通過非顫栗產熱來控制體重，調節能量代謝，其中UCP1發揮關鍵作用，UCP1通過介導物質氧化磷酸化及ATP生成解偶聯，將能量以熱能形式耗散，增加產熱和能量代謝率[20-21]。本研究觀察到復合蛋白肽可以增加OXPHOS、UCP1的表達，其中高劑量組可以顯著增加復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的表達，低、中劑量組增加了Ⅱ、Ⅳ、Ⅲ的表達，且均具有統計學差異。因此，復合蛋白肽可以增強棕色脂肪線粒體氧化磷酸化。

人群研究顯示，增加蛋白質的攝入不僅有助于減重，且對控制腹部脂肪的儲存具有長效作用[22-24]。腹部肥胖是代謝綜合征最典型的表現，也是脂肪組織功能失調的標志，可導致細胞炎性因子分泌的增加，與甘油三酯的過度蓄積與血糖血脂異常等密切相關[25-27]。同時，在該試驗中觀察到復合蛋白肽主要降低了臟器周圍白色脂肪含量，油紅O染色顯示，給予復合蛋白肽組動物肝臟脂肪含量明顯降低。

綜上，通過對實驗動物體重變化、血脂變化、肝臟脂肪蓄積及棕色脂肪組織能量代謝相關蛋白表達水平的探究可知，復合蛋白肽可以降低動物體重、脂肪含量和血脂水平，減少肝臟的脂肪蓄積，激活棕色脂肪組織中OXPHOS和UCP1的表達并刺激產熱，從而控制高脂誘導大鼠肥胖。

參考文獻

[1]Pan XF，Wang L，Pan A. Epidemiology and determinants of obesity in China[J]. Lancet Diabetes Endocrinol，2021，9（6）：373-392.

[2]Engin A. The definition and prevalence of obesity and metabolic syndrome[J]. Adv Exp Med Biol，2017（960）：1-17.

[3]Martin KA，Mani MV，Mani A. New targets to treat obesity and the metabolic syndrome[J]. Eur J Pharmacol，2015，763（Pt A）：64-74.

[4]Maimaiti M，Zhao XY，Jia MH，et al. How we eat determines what we become： opportunities and challenges brought by food delivery industry in a changing world in China[J]. Eur J Clin Nutr，2018，72（9）：1282-1286.

[5]Baer DJ，Stote KS，Paul DR，et al. Whey protein but not soy protein supplementation alters body weight and composition in free-living overweight and obese adults[J]. J Nutr，2011，141（8）：1489-1494.

[6]Dong JY，Zhang ZL，Wang PY，et al. Effects of high-protein diets on body weight，glycaemic control，blood lipids and blood pressure in type 2 diabetes： meta-analysis of randomised controlled trials[J]. Br J Nutr，2013，110（5）：781-789.

[7]Yu Z，Nan F，Wang LY，et al. Effects of high-protein diet on glycemic control，insulin resistance and blood pressure in type 2 diabetes： A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Clin Nutr，2020，39（6）：1724-1734.

[8]趙冬，時藝珊，趙颯. 高蛋白飲食對中青年肥胖2型糖尿病患者腦腸肽及胰島β細胞功能的影響[J]. 四川醫學，2021，42（4）：400-404.

[9]Yilmaz SK，Eskici G，Mertoglu C，et al. Effect of different protein diets on weight loss，inflammatory markers，and cardiometabolic risk factors in obese women[J]. J Res Med Sci，2021（26）：28.

[10]Freudenberg A，Petzke KJ，Klaus S. Comparison of high-protein diets and leucine supplementation in the prevention of metabolic syndrome and related disorders in mice[J]. J Nutr Biochem，2012，23（11）：1524-1530.

[11]Gardner CD，Kiazand A，Alhassan S，et al.Comparison of the Atkins，Zone，Ornish，and LEARN diets for change in weight and related risk factors among overweight premenopausal women： The A TO Z weight loss study： A randomized trial[J]. JAMA，2007，297（9）：969-977.

[12]Wycherley TP，Moran LJ，Clifton PM，et al. Effects of energy-restricted high-protein，low-fat compared with standard-protein，low-fat diets： a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Am J Clin Nutr，2012，96（6）：1281-1298.

[13]Skov AR，Toubro S，Ronn B，et al. Randomized trial on protein vs carbohydrate in ad libitum fat reduced diet for the treatment of obesity[J]. Int J Obesity，1999，23（5）：528-536.

[14]Belza A，Ritz C，Sorensen MQ，et al. Contribution of gastroenteropancreatic appetite hormones to protein-induced satiety[J]. Am J Clin Nutr，2013，97（5）：980-989.

[15]Moon J，Koh G. Clinical evidence and mechanisms of high-protein diet-induced weight loss[J]. J Obes Metab Syndr，2020，29（3）：166-173.

[16]Westerterp-Plantenga MS. Protein intake and energy balance[J]. Regul Pept，2008，149（1-3）：67-69.

[17]Song G，Kim HL，Jung Y，et al. Fruit of Hovenia dulcis thunb. Induces nonshivering thermogenesis through mitochondrial biogenesis and activation by SIRT1 in high-fat diet-fed obese mice and primary cultured brown adipocytes[J]. J Agr Food Chem，2020，68（24）：6715-6725.

[18]Sparks LM，Xie H，Koza RA，et al. A high-fat diet coordinately downregulates genes required for mitochondrial oxidative phosphorylation in skeletal muscle[J]. Diabetes，2005，54（7）：1926-1933.

[19]Yi HS，Chang JY，Shong M. The mitochondrial unfolded protein response and mitohormesis： a perspective on metabolic diseases[J]. J Mol Endocrinol，2018，61（3）：91-105.

[20]袁慧琦，侯少貞. 影響棕色脂肪組織產熱活性因素的研究進展[J]. 動物醫學進展，2016，37（10）：98-103.

[21]Marlatt KL，Ravussin E. Brown adipose tissue： An update on recent findings[J]. Curr Obes Rep，2017，6（4）：389-396.

[22]Weigle DS，Breen PA，Matthys CC，et al. A high-protein diet induces sustained reductions in appetite，ad libitum caloric intake，and body weight despite compensatory changes in diurnal plasma leptin and ghrelin concentrations[J]. Am J Clin Nutr，2005，82（1）：41-48.

[23]Westerterp-Plantenga MS，Nieuwenhuizen A，Tome D，et al. Dietary protein，weight loss，and weight maintenance[J]. Annu Rev Nutr，2009（29）：21-41.

[24]Campos-Nonato I，Hernandez L，Barquera S. Effect of a high-protein diet versus standard-protein diet on weight loss and biomarkers of etabolic syndrome： A randomized clinical trial[J]. Obes Facts，2017，10（3）：238-251.

[25]Despres JP，Lemieux I. Abdominal obesity and metabolic syndrome[J]. Nature，2006，444（7121）：881-887.

[26]Smith U. Abdominal obesity： a marker of ectopic fat accumulation[J]. J Clin Invest，2015，125（5）：1790-1792.

[27]Despres JP，Lemieux I，Bergeron J，et al. Abdominal obesity and the metabolic syndrome： contribution to global cardiometabolic risk[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28（6）：1039-1049.

Abstract：ObjectiveTo study the effect of complex protein peptide on glucolipid metabolism in obese rats induced by high fat diet. MethodMale SD rats were randomly divided into obesity model group and control group. Obesity model group was fed with high-fat diet for 4 weeks. Selected obesity-sensitive rats were randomly divided into LPP，MPP and HPP groups，containing 25%，50% and 100% protein peptide complex in feed respectively. The model control group 1 （MC1） was set for LPP and MPP with equal energy，and the model control group 2 （MC2） for HPP. Related index were detected after 4-week intervention with protein peptide complex，including body weight，fat content，liver fat storage and brown fat energy metabolism related proteins. ResultProtein peptide complex could significantly reduce the body weight，fat content and lipid level of obese rats，reduce liver lipid droplet density，and increase mitochondrial oxidative phosphorylation （OXPHOS） and uncoupling protein 1 （UCP1） expression levels.ConclusionProtein peptide complex could reduce the visceral fat and white fat of obese rats induced by HFD，which might be related to prompt the OXPHOS and UCP1 expression in brown adipose tissue.

Keywords： protein peptide complex; high-fat diet; obesity; glucolipid metabolism