低氧脅迫對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物多樣性的影響

陳坤海,覃惠明,劉忠誠(chéng),陳貴榮

(1.柳城縣漁業(yè)技術(shù)推廣站,廣西 柳城 545200;2.柳城縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西 柳城 545200)

尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)原產(chǎn)于非洲,是世界性優(yōu)良淡水養(yǎng)殖品種。羅非魚(yú)具有生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、食性廣等特點(diǎn)[1],其肉質(zhì)緊實(shí)、口味鮮美、無(wú)肌間小刺、富含多種人體必需脂肪酸。羅非魚(yú)自1958年引進(jìn)中國(guó)以來(lái),已成為廣東、廣西、海南等地的主要水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象[2]。

中國(guó)羅非魚(yú)的養(yǎng)殖方式主要是集約化規(guī)模養(yǎng)殖[3],水體中的溶氧水平是養(yǎng)殖過(guò)程中的關(guān)鍵指標(biāo)之一。水體中溶解氧(DO)濃度低于2 mg/L為低氧狀態(tài),魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境中,會(huì)導(dǎo)致其呼吸頻率下降、攝食量減少、生長(zhǎng)繁殖能力下降,甚至造成魚(yú)類(lèi)死亡[4]。為確保羅非魚(yú)正常生長(zhǎng)繁殖,通常利用增氧機(jī)或換水等方法將水體溶氧量控制在3～7 mg/L之間[5],但在極端惡劣天氣或長(zhǎng)途運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)低氧情況。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,低氧脅迫明顯抑制鯉(Cyprinuscarpio)的繁殖[6],促使瓦氏黃顙魚(yú)(Pelteobagrusvachelli)腸道組織的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[7],影響吉富羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)肝臟脂肪酸組成和部分血液生化指標(biāo),將緩慢影響羅非魚(yú)的生長(zhǎng)。低氧會(huì)為致病厭氧菌提供生長(zhǎng)繁殖條件,加速其在腸道中的定殖,破壞腸道有益菌的多樣性及豐富度,進(jìn)而導(dǎo)致魚(yú)腸道損傷及病變,增加致死風(fēng)險(xiǎn)[8]。但目前有關(guān)低氧脅迫對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物多樣性的研究較少。本研究以羅非魚(yú)腸道組織內(nèi)容物為樣本,研究低氧處理對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物菌群組成及菌群功能作用的影響,為探討羅非魚(yú)腸道微生物的影響因素及健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用尼羅羅非魚(yú)購(gòu)買(mǎi)于柳州市城中區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng),在廣西科技大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室魚(yú)缸中進(jìn)行循環(huán)水系統(tǒng)馴養(yǎng)2周。馴化期間,養(yǎng)殖用水(曝氣24 h以上的除氯自來(lái)水),溶氧量:6.5～7.5 mg/L,pH值:7.3～7.9,水溫保持在(28±1)℃。每日9:00和17:00投喂商業(yè)飼料(粗蛋白質(zhì)28.0%、粗脂肪6.0%)。馴化結(jié)束后,隨機(jī)選取36尾初體重為(20.00±0.1)g健康羅非魚(yú)進(jìn)行試驗(yàn)。共設(shè)定2個(gè)處理組:低氧組(DO:1.0～1.5 mg/L)和對(duì)照組(DO:6.5～7.5 mg/L),每組設(shè)置3個(gè)平行,每個(gè)平行6尾羅非魚(yú),分別放入6個(gè)魚(yú)缸中,進(jìn)行為期2周的養(yǎng)殖。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 按照DNA提取試劑盒(Omega Biotek,U.S.)說(shuō)明書(shū)提取總DNA,用超微量分光光度計(jì)(SMA 6000,Merinton,Beijing)檢測(cè)DNA濃度,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度。以338 F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806 R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)作為引物對(duì)16S rDNA基因V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。AXyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收PCR產(chǎn)物。利用QuantiFiuorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.2.2 Illumina文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 利用美吉生物云平臺(tái) (https://cloud.majorbio.com) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。選擇ASV分類(lèi)學(xué)水平,Sobs指數(shù)類(lèi)型,利用mothur-1.30分析軟件制作稀釋曲線圖。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析α多樣性指數(shù)組間差異顯著性。利用R-3.3.1(Vegan)軟件計(jì)算β多樣性 Bray-Curtis距離矩陣,使用UPGMA算法構(gòu)建樣本等級(jí)聚類(lèi)樹(shù),相同距離矩陣下進(jìn)行主成分分析,比較不同樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異程度。利用python-2.7分析軟件,分析不同樣品在門(mén)、屬分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)方法進(jìn)行雙尾檢驗(yàn),在門(mén)、屬水平上評(píng)估物種豐度差異的顯著性水平,獲取兩組間具有顯著性差異的物種信息。最后基于PICRUSt2功能預(yù)測(cè)、BugBase表型預(yù)測(cè)、FAPROTAX功能預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù),在門(mén)、屬水平上進(jìn)行不同樣本菌群表型和功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性分析

通過(guò)分析α多樣性評(píng)估低氧組和對(duì)照組中微生物群落的多樣性和豐富度。由表1可知,低氧組和對(duì)照組微生物群落ace、chao、sobs及pd指數(shù)無(wú)顯著性差異;低氧組微生物群落Shannon指數(shù)顯著高于對(duì)照組;Simpson指數(shù)顯著低于對(duì)照組測(cè)序覆蓋率指數(shù),且低氧組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。

表1 羅非魚(yú)腸道菌群α多樣性分析

如圖1所示(封三),在相同距離算法下,對(duì)所有樣本進(jìn)行ASV層級(jí)聚類(lèi)分析,大體可分為2支,低氧組(Oxy_1—Oxy_6)聚為一支,對(duì)照組(Ctrl_1—Ctrl_6)聚為一支,表明低氧組與對(duì)照組的腸道微生物菌群之間存在顯著性差異。

2.2 腸道菌群組成分析

通過(guò)韋恩圖分析低氧組和對(duì)照組物種組成相似性及重疊情況。如圖2A(封三)所示,在門(mén)分類(lèi)水平上,低氧組和對(duì)照組共有的微生物菌群為12,低氧組特有的微生物菌群為0,對(duì)照組特有的微生物菌群為10;如圖2B(封三)所示,在屬分類(lèi)水平上,低氧組和對(duì)照組共有的微生物菌群為85,低氧組特有的微生物菌群為43,對(duì)照組特有的微生物菌群為148;如圖2C(封三)所示,在ASV分類(lèi)水平上,低氧組和對(duì)照組共有的微生物菌群為150,低氧組特有的微生物菌群為164,對(duì)照組特有的微生物菌群為305。

2.3 腸道菌群差異分析

如圖3A(封三)所示,通過(guò)門(mén)水平上的Wilcoxon秩和檢驗(yàn),低氧組中放線菌門(mén)(Actinobacteriota)顯著低于對(duì)照組,Planctomycctota、梭桿菌門(mén)(Fusobacteriota)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組。如圖3B(封三)所示,對(duì)主要菌屬進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn),低氧組代爾夫特菌屬(Delftia)和Pseudorhodoplanes相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組,Tundrisphaera、Methylobacterium-Methylorubrum、屈曲桿菌屬(Ancylobacter)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、井桿菌屬(Phreatobacter)顯著高于對(duì)照組,軍團(tuán)桿菌屬(Legionella)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)顯著高于對(duì)照組。

2.4 PICRUSt2功能預(yù)測(cè)

對(duì)低氧組和對(duì)照組羅非魚(yú)腸道微生物菌群基因進(jìn)行PICRUSt2功能預(yù)測(cè)。如圖4(封三)所示,羅非魚(yú)腸道微生物菌群功能基因主要參與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、不同環(huán)境中的微生物代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、雙組分系統(tǒng)等相關(guān)通路。低氧脅迫整體降低了羅非魚(yú)腸道菌群的代謝和生物合成,特別是氨基酸降解、脂肪酸代謝、氨基酸生物合成、碳代謝、氮代謝等,對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物菌群的能量代謝方面具有抑制作用。

3 結(jié)論

綜上所述,低氧脅迫提高了羅非魚(yú)腸道微生物菌群的多樣性,降低放線菌門(mén)、代爾夫特菌屬和根瘤菌屬相對(duì)豐度,顯著提高M(jìn)ethylobacterium-Methylorubrum致病菌相對(duì)豐度。低氧脅迫整體降低羅非魚(yú)腸道菌群的代謝和生物合成,造成羅非魚(yú)代謝紊亂,增加其患病的風(fēng)險(xiǎn)。