牛奶中黃曲霉毒素M族檢測能力驗證及創建二級全掃描質譜圖

鄭 平，王 冬，鄒康平，陳 斐，趙宇凡，荊振楊

（常州市金壇區檢驗檢測中心，江蘇常州 213200）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）屬于雙呋喃環類毒素，是一種次級代謝產物，由黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產生，約有20種衍生物，會對人和動物造成嚴重危害[1]。飼料受到黃曲霉毒素B1、B2污染，被動物食用，會代謝產生黃曲霉毒素M1、M2[2]，這些代謝產物會存在于乳、蛋、尿和肉中，最常見的是乳及乳制品中[3]。《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中規定，乳制品中黃曲霉毒素M1的限量不得超過0.5 μg·kg-1，目前關于奶及奶制品中對黃曲霉毒素B1和M1的研究較多[4-6]，而對黃曲霉毒素M1、M2同時檢測的研究較少。同時由于食品基質的復雜性，基質效應可能會導致假陽性的發生，而離子阱串聯質譜法能獲得目標離子的二級質譜圖，可以對目標化合物進一步定性[7]。目前使用該模式同時檢測牛奶中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2的研究較少。本研究主要對GB 5009.24—2016第一法進行驗證，確保本檢驗機構能對牛奶中AFTM1和AFTM2進行準確檢測。同時利用儀器自帶的離子阱功能（Q-Trap），建立黃曲霉毒素M1、M2的二級全掃描質譜圖，對樣品中是否含有目標物質進行進一步定性、確認。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

所用牛奶樣品（預包裝）均為江蘇省常州市金壇區市售；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；乙酸銨（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；氯化鈉、十二水和磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和氯化鉀（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；鹽酸（分析純，天津科密歐試劑公司）；黃曲霉毒素M1（C17H12O7）標準品5 μg·mL-1、黃曲霉毒素M2標準品（C17H14O7）10 μg·mL-1和13C17-AFTM1同位素溶液（13C17H14O7）0.5 μg·mL-1，均購自壇墨質檢標準物質中心。

1.2 儀器和設備

電子天平AB265-S（精度：0.00001 g，梅特勒-托利多科技（中國）有限公司）；全自動固相萃取儀、全自動氮吹器（睿科集團股份有限公司）；Sciex Qtrap-4500超高效液相色譜串聯質譜儀（帶離子阱）（上海愛博才思儀器貿易有限公司）；全自動離心機（上海手術器械廠）；黃曲霉毒素M族免疫親和柱（3 mL，柱容量≥150 ng）（涿州凱斯科生物技術有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

樣品提取和凈化步驟嚴格按照《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）第一法中5.1.1和5.2.2進行。空白實驗：在不取樣的情況下，按照上述提取和凈化程序進行空白試驗，需要確認不含有干擾待測成分的物質，上述前處理需全程避光。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A為5 mmol·L-1乙酸銨溶液，B為乙腈＋甲醇（50＋50）；流速：0.3 mL·min-1；洗脫方式：梯度洗脫。1.3.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；正模式掃描；多反應監測（MRM）模式采集；氣簾氣（CUR）：30 psi；霧化氣（GS1）：50 psi；輔助氣（GS2）：50 psi；碰撞氣（CAD）：medium；離子噴霧電壓：4500 V；輔助氣溫度（TEM）：550 ℃。優化儀器條件，使目標色譜峰的靈敏度最高。

1.3.4 方法學驗證

按照《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F和《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）中第一法的要求，本試驗方法驗證主要包括下面幾項。

（1）校準曲線驗證。配制AFTM1和AFTM2的濃度均為0.05 μg·L-1、0.40 μg·L-1、0.80 μg·L-1、1.00 μg·L-1、2.00 μg·L-1、4.00 μg·L-1、6.00 μg·L-1和8.00 μg·L-1，13C17-AFTM1濃度為0.45 μg·L-1的系列標準溶液，供HPLC-MS/MS測定，得到標準曲線回歸方程，其線性相關系數r應大于0.99。

（2）準確度驗證。牛奶中黃曲霉毒素M1限量為0.5 μg·kg-1，目前我國對黃曲霉毒素M2的限量沒有明確規定，GB 5009.24—2016中第一法中規定AFTM1和AFTM2的定量限均為0.015 μg·kg-1。因此稱取18份陰性牛奶樣品，依次添加0.015 μg·kg-1、0.100 μg·kg-1和0.500 μg·kg-1共3個水平濃度，每個水平需做6次重復試驗，進行準確度驗證。

（3）方法定量限驗證。定量限是信噪比等于10時的濃度，該標準方法規定AFTM1和AFTM2的定量限均為0.015 μg·kg-1。稱取2份陰性牛奶樣品，分別添加0.015 μg·kg-1的AFTM1和AFTM2，進行處理，測定。如果2份加標樣品中AFTM1和AFTM2的信噪比S/N均＞10，證明可以滿足方法定量限要求。

（4）精密度驗證。稱取3份陰性牛奶樣品，依次添加0.015 μg·kg-1、0.100 μg·kg-1和0.500 μg·kg-1共3個水平濃度，上機重復測定次數至少為6次，計算實驗室內變異系數。

1.3.5 創建目標物質二級質譜圖

在上述儀器條件基礎上建立多反應監測觸發增強子離子掃描模式（MRM-IDA-EPI），設定信息依賴觸發閾值：1000 cps；動態背景扣除模式；子離子掃描速度10000 Da·s-1，掃描范圍50～350（m/z）；EPI：1個；碰撞能量為35 V。建立黃曲霉毒素M1、M2的二級全掃描質譜圖，獲得更全面的碎片信息。

2 結果與分析

2.1 工作曲線及線性相關系數驗證結果

按照設定的儀器方法，將標準系列溶液從低到高濃度進行檢測，以AFTM1和AFTM2色譜峰與13C17-AFTM1峰面積比值-濃度比值作圖，得到AFTM1和AFTM2的標準曲線方程分別為y=2.71751x-0.00556和y=2.05221x+0.01764，相關系數r分別為0.99901和0.99917，滿足r＞0.99的要求。

2.2 方法準確度驗證結果

以陰性樣品加標回收率來驗證方法的準確度，在陰性牛奶樣品中分別添加0.015 μg·kg-1、0.100 μg·kg-1和0.500 μg·kg-13水平濃度的黃曲霉毒素M1、M2，每個水平需做6次重復試驗，加標回收率結果見表1。加標量在0.015～0.500 μg·kg-1時，平均回收率為97.0%～108.0%，相對標準偏差（RSD）≤20%，滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F中關于濃度小于0.1 mg·kg-1時，回收率滿足60%～120%的要求。

表1 AFTM1和AFTM2的加標回收率及相對標準偏差（n=6）

2.3 方法定量限驗證結果

由表2可知，該方法中AFTM1和AFTM2定量限0.015 μg·kg-1處的信噪比（S/N）為46～78，均大于10，表明按照上述前處理步驟處理樣品，可以滿足標準方法中規定的定量限。

表2 方法定量限驗證數據

2.4 方法精密度驗證結果

由表3可知，在陰性牛奶樣品中添加黃曲霉毒素M1、M20.015 μg·kg-1、0.100 μg·kg-1和0.500 μg·kg-1共3個水平進行6次重復試驗，計算得到實驗室變異系數為5.1%～11.8%，滿足GB/T 27404—2008附錄F當被測組分含量≤1.0 μg·kg-1時，變異系數≤30%的要求。

表3 方法精密度測試數據

2.5 創建二級質譜圖

在多反應監測-信息關聯-增強子離子掃描模式（MRM-IDA-EPI）下分別建立標準物質和牛奶樣品中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2的二級碎片圖，通過比對，匹配值越高，定性為目標物的可能性越大。研究表明，準確確認是目標化合物的話，需要匹配值＞70%[8-9]。由圖1可知，牛奶樣品中僅AFTM1的二級碎片圖與AFTM1標準品的二級碎片圖基本一致，經數據庫計算匹配值為97.4%；牛奶樣品中AFTM2與AFTM2標準品二級碎片圖的匹配值為44.6%，說明牛奶樣品中僅含有AFTM1，不含有AFTM2。因此建議在日常檢驗中建立目標化合物標準物質的二級質譜圖或陽性樣品的二級碎片圖，添加到譜庫，更新譜庫，更有利于日常檢驗中對陽性物質的鑒定、確認。

圖1 EPI模式下黃曲霉毒素M族的二級碎片譜圖.

3 結論

食品新項目擴項工作要求在申請檢驗參數擴項資質前，需要對檢驗標準進行方法驗證，本實驗室按照《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求，對《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）中第一法（同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法）進行方法驗證。結果表明牛奶中黃曲霉毒素M1、M2在0.015～0.500 μg·kg-1有良好的線性、相關系數r在0.995以上，能滿足方法定量限0.015 μg·kg-1處信噪比的要求，加標量在0.015～0.500 μg·kg-1時，平均回收率為97.0%～108.0%、相對標準偏差≤20%，符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）及《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）第一法的要求。以上表明本實驗室具備使用GB 5009.24—2016中第一法開展牛奶中黃曲霉毒素M1、M2檢測的能力。此外，本文還建立了液相色譜四極桿串聯離子阱復合質譜法同時篩查和定量牛奶中黃曲霉毒素M1、M2的方法，獲得黃曲霉毒素M1、M2的二級全掃描質譜圖，實現對牛奶中黃曲霉毒素M1、M2的篩查、確證。