肉品與屠宰場環(huán)境細(xì)菌相關(guān)性的研究

劉夢竹，鄧森榮，康樺華，魏琦麟，涂 杜，徐志宏*

（1.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心，廣東肇慶 526238；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；3.茂名市鄉(xiāng)村振興發(fā)展指導(dǎo)中心，廣東茂名 525021）

肉中的微生物主要來源于生產(chǎn)、運(yùn)輸以及銷售環(huán)境，在生產(chǎn)、運(yùn)輸和銷售的過程中，環(huán)境中的微生物通過人為接觸等途徑污染豬肉[1]。環(huán)境中的微生物主要分為腐敗菌與致病菌兩大類。腐敗菌作用于豬肉，致使豬肉腐敗變質(zhì)，明顯縮短豬肉的貯藏貨架期[2]；致病菌的生長繁殖導(dǎo)致肉類腐敗的同時還會產(chǎn)生有毒有害的物質(zhì)，引發(fā)食品安全問題。由于生產(chǎn)環(huán)境中存在著大量的微生物，即使屠宰場的環(huán)境達(dá)到食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，生豬肉產(chǎn)品仍不可避免地被環(huán)境微生物所污染[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、瓊脂培養(yǎng)基（DHL）、營養(yǎng)肉湯（LB）、瓊脂（NA）、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、麥康凱、假單胞菌分離瓊脂培養(yǎng)基（CFC）、亞硫酸鉍瓊脂（BS），廣東環(huán)凱生物科技公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基（VRBA），廣州叢源儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

J11101110生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Mastercycler X50S PCR儀，德國Eppendorf公司；MPI多功能微生物培養(yǎng)箱，廣州市尤德生物科技有限公司；5418常溫臺式離心機(jī)德國Eppendorf公司；DYY-8C電泳儀，北京市六一儀器廠；ZF-258凝膠成像分析系統(tǒng)，上海嘉鵬科技有限公司；5804R臺式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 環(huán)境和豬肉樣品的取樣

屠宰場環(huán)境樣品的采集：每個屠宰環(huán)節(jié)分別有相應(yīng)工作區(qū)域，采用棉拭子進(jìn)行涂擦，采集到的樣品進(jìn)行無污染封裝，待檢。

屠宰場生豬肉樣品的采集：隨機(jī)選取50頭生豬，分別在生豬的背脊、肝臟、胰臟、腹部肉以及脾臟部位進(jìn)行樣品采集。

1.3.2 細(xì)菌微生物的分離與培養(yǎng)

樣品棉拭子放進(jìn)事先配好的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)36 h，漩渦振蕩器充分振蕩，梯度稀釋后選取適宜濃度菌液，分別均勻涂布于DHL、PCA、假單胞菌培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h；觀察菌落形態(tài)，將不同形態(tài)的單菌落挑進(jìn)液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)36 h，保存菌液備用。1.3.3 細(xì)菌核酸的提取、PCR擴(kuò)增及測序菌液8000 r·min-1離心10 min，去上清，取沉淀，加300 μL滅菌生理鹽水混勻；菌液煮沸10 min，冰浴5 min，10000 r·min-1離心10 min，取上清，即為模板DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；30個循環(huán)95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；72 ℃延伸10 min，10 ℃保持。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用BLAST分析，確定分離細(xì)菌所屬菌種。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰場環(huán)境細(xì)菌的分離與鑒定

屠宰場中的環(huán)境微生物種類豐富，不同的取樣地點(diǎn)其微生物種類有所不同。本實(shí)驗(yàn)采集了屠宰場環(huán)境中的細(xì)菌，其鑒定結(jié)果見表1。屠宰場環(huán)境中細(xì)菌主要是致病菌及腐敗菌，致病菌包括肺炎克雷伯菌、不動桿菌、溶血性葡萄球菌等，腐敗菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等。不同的采樣地點(diǎn)檢測到的致病菌種類和腐敗菌種類有較大的差異，不同的環(huán)境檢測點(diǎn)主要菌種不同。

表1 環(huán)境微生物的檢測鑒定結(jié)果

2.2 豬肉產(chǎn)品上的細(xì)菌分離與鑒定

豬肉上細(xì)菌分離與鑒定結(jié)果如表2所示，豬肉中的細(xì)菌主要包含致病菌與腐敗菌，致病菌有肺炎克雷伯菌、不動桿菌、變形桿菌等，腐敗菌有金黃色葡萄球菌、假單胞菌、大腸桿菌等。脾臟中同時含有致病菌和腐敗菌，且含有的微生物種類最多，主要包含假單胞菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌。腹部肉微生物含有種類次之，主要有致病菌肺炎克雷伯菌和腐敗菌大腸桿菌。肝臟肉中含有的微生物是腐敗微生物大腸桿菌，而脊背肉中沒有檢測到腐敗菌，只檢測到一種條件致病菌不動桿菌。

表2 豬肉產(chǎn)品中檢測到的微生物鑒定結(jié)果

2.3 豬肉與屠宰場環(huán)境細(xì)菌相關(guān)性分析

屠宰場環(huán)境檢測到的主要微生物有肺炎克雷伯菌、不動桿菌、溶血性葡萄球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等，肉樣品中檢測到的微生物主要有肺炎克雷伯菌、不動桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，豬肉樣品中檢測到的主要微生物在屠宰場環(huán)境中均檢測到，屠宰場豬肉產(chǎn)品上的微生物與屠宰場環(huán)境中的微生物之間存在相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

相關(guān)文獻(xiàn)表明，健康豬肉上的微生物主要源自生產(chǎn)、運(yùn)輸、加工以及銷售過程中的環(huán)境污染[4-5]。本文通過對屠宰場生產(chǎn)環(huán)節(jié)的環(huán)境以及豬的背脊肉、肝臟等部位進(jìn)行樣品采集，分離鑒定樣品中的微生物，進(jìn)行結(jié)果對比分析可以得知，在生豬肉生產(chǎn)的過程中，屠宰場環(huán)境中存在著各種各樣的細(xì)菌，其中包括致病菌與腐敗菌，同時環(huán)境細(xì)菌與豬肉上的細(xì)菌的對比結(jié)果可以說明兩者具有相關(guān)性。在生豬肉的生產(chǎn)過程中，如果生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生沒有達(dá)標(biāo)，環(huán)境中的細(xì)菌會對生豬肉造成污染，細(xì)菌在適宜的條件下大量生長繁殖，分解生豬肉的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，造成豬肉腐敗變質(zhì)，引發(fā)食品安全問題。