一起鼠傷寒沙門菌單相變異株引起的食源性疾病事件病原學分析

李 濤，張 璽，張曉妮

（臨沂市疾病預防控制中心細菌檢驗科，山東臨沂 276000）

沙門菌是導致人類和動物胃腸炎和腹瀉的最常見病原體之一，其中鼠傷寒沙門菌（S.typhimurium）在全球沙門氏菌感染中占很大比例[1]。鼠傷寒沙門菌單相變異株由于編碼基因（如fljA、fljB或hin）的缺失，導致沙門菌第二相鞭毛蛋白表達方面產生缺陷[2]。近年來，歐洲、美國和亞洲的臨床分離株中，鼠傷寒沙門菌單相變異株I4,[5],12:i:-大幅增加，其流行趨勢已成為全球公眾關注的問題[3]。

2020年4月，山東省臨沂市某機構發生一起食源性疾病暴發事件，患者主要表現為發熱、腹瀉并伴有惡心、嘔吐、腹痛等癥狀。由于該機構相對封閉，患者有明確的共同就餐史，結合臨床表現及血常規檢測結果，判斷為細菌性食源性疾病事件，隨后采集可疑樣本至實驗室進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

采集樣本包括患者糞便17份，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子24份。

沙門菌診斷血清（丹麥SSI）；XbaI限制性內切酶（大連TaKaRa）；革蘭氏陰性菌藥敏檢測板(上海復星）；沙門菌血清型分子鑒定試劑盒（山東美正）；標準菌株H9812及ATCC25922均來自山東省疾控中心。

熒光PCR擴增儀（美國賽默飛）；全自動微生物分析系統VITEK2（法國梅里埃公司）；CHEFMAPPER脈沖場凝膠電泳儀及成像系統和全自動凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR檢測

使用商品化試劑盒應用Realtime PCR法對采集到的糞便樣本進行沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和致瀉大腸埃希氏菌的多病原檢測。

1.2.2 致病菌的分離及鑒定

糞便樣本參照《感染性腹瀉診斷標準》（WS 271—2007）進行分離培養，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子樣本按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）要求進行檢測。

1.2.3 菌株血清型鑒定

使用沙門菌血清型分子鑒定試劑盒和沙門菌診斷血清鑒定分離株血清型。

1.2.4 藥敏試驗

采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC），按照商品化藥敏檢測板說明書進行具體操作和結果判讀，使用標準菌株ATCC25922作為質控對照。

1.2.5 脈沖場凝膠電泳分型

參照國家致病菌識別網沙門菌PFGE分子分型方法，以H9812為標準Marker。限制性內切酶XbaI進行酶切，經電泳、染色，獲得圖譜，上傳至國家致病菌識別網平臺進行聚類分析。

1.2.6 全基因組測序分析

使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KitVer.3.0試劑盒提取分離株核酸后，送諾禾致源生物信息科技有限公司進行全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）。測序數據采用Center for Genomic Epidemiology（http://www.genomicepidemiology.org/）在線分析工具，預測沙門菌血清型[4]、ST型別[5]、耐藥表型及耐藥基因[6]，基于VFDB（Virulence Factor Database）數據庫[7]對沙門菌分離株毒力基因進行注釋分析。

2 結果與分析

2.1 熒光定量PCR鑒定結果

結果顯示11份患者糞便沙門菌基因檢測陽性，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子樣本檢測結果均為陰性。

2.2 分離鑒定及血清分型結果

41份流調樣本共分離沙門菌7株，編號分別為SDLY20Sal001、SDLY20Sal002、SDLY20Sal003、SDLY20Sal004、SDLY20Sal005、SDLY20Sal007和SDLY20Sal011，均來自患者糞便樣本。食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子樣本增菌培養后，沙門菌檢測結果均為陰性。分離株經沙門菌血清型分子鑒定試劑盒鑒定為鼠傷寒沙門菌，診斷血清凝集結果為4,12:i:-，WGS測序數據預測血清型為I4,[5],12:i:-，其ST型為34。

2.3 脈沖場凝膠電泳（PFGE）結果

7株分離株的PFGE帶型一致，判斷此次事件中患者感染同一鼠傷寒沙門菌，該分離株與臨沂市2019年收集的兩簇鼠傷寒沙門菌相似度只有47.56%和35.33%（圖1）。

圖1 7株鼠傷寒沙門菌PFGE聚類分析圖譜

2.4 藥物敏感試驗及WGS耐藥基因分析結果

藥物敏感試驗結果顯示，本案例沙門分離株對氨芐西林、四環素、鏈霉素、多西環素及米諾環素耐藥，ResFinder4.0預測分離株攜帶6個耐藥基因，分別是氨基糖苷類耐藥基因[aac（6’）-Iaa、aph（6）-Id、aph（3’’）-Ib]、β-內酰胺類耐藥基因（blaTEM-1B）、磺胺類耐藥基因（sul2）及四環素類耐藥基因tet（B）。阿米卡星、氨芐西林-克拉維酸鉀及磺胺甲惡唑3種抗生素藥敏試驗與WGS耐藥表型預測不同（表1）。

表1 藥物敏感試驗及WGS耐藥性預測分析結果

2.5 毒力基因分析結果

基于VFDB數據庫分析本案例分離株WGS測序數據共注釋110個毒力基因，其中101個毒力基因可根據文獻中描述的沙門菌屬致病的4個關鍵階段[8]進行分類（表2）。與附著相關毒力因子有bcf、csg、fim、lpf、shd、mis，與侵襲/細胞內存活相關毒力因子有inv、org、pip、prg、sic、sif、sip、ssp、slr、sod、sop、sig、spa、spt，與巨噬細胞內存活相關毒力因子有mgt、spi、ssa、ssc、sse、srf，未比對出與系統傳播相關毒力因子，前3個階段對應毒力基因數量分別是26、40及35。

表2 沙門菌致病機制4個已知步驟的毒力基因分布情況

3 結論與討論

我國鼠傷寒沙門菌分離株中鼠傷寒沙門菌單相變異株占32.67%，自2011年來呈上升趨勢，尤其值得注意的是其中兒童感染病例占63.29%[9]。由于傳統血清分型方法局限[3]，本案例最終通過WGS數據分析確定分離株血清型，引起該事件的沙門菌是鼠傷寒沙門菌單相變異株I4,[5],12:i:-，結合PFGE分子分型結果，判定該分離株為引起本次事件暴發的致病菌。

我國沙門菌分離株常見耐藥基因多與磺胺類、β-內酰胺類、四環素類和酚類抗生素相關，最常見的耐藥基因是aph（3’）-IIa、blaCTX-M-55和blaTEM-1B，藥敏實驗結果和基于WGS的表型預測結果往往高度一致[9]，基于WGS的耐藥表型預測在指導臨床用藥方面有廣闊的應用前景。本案例分離株藥敏試驗結果中阿米卡星及磺胺甲惡唑2種抗生素與WGS耐藥表型預測不同，耐藥基因分析結果顯示存在與2種抗生素對應的耐藥基因，提示可通過分析這2個耐藥基因序列，進一步探尋其耐藥機制。

GAO等[10]按照與沙門菌發病相關的4個關鍵階段，即附著、入侵、巨噬細胞內存活和系統傳播，對227個沙門菌屬毒力基因進行分類，4個階段對應的毒力基因數量分別是49、73、39和66。毒力相關基因中，目前共發現129種不同的毒力因子[9]。劉理慧等[11]提出一般菌株的致病性越強，其攜帶的毒力基因的種類和/或數量越多。結合本案例毒力基因預測結果推測，該鼠傷寒沙門菌單相變異株致病性相對較弱，引起全身感染性疾病表現概率較低。

在食源性疾病事件調查中，多病原篩查PCR技術能夠與傳統培養方法互補，實現病原的快速確定，縮短實驗室檢測時間，對流行病學調查有積極的指導意義；PFGE分子分型技術則一直是致病菌溯源分析的“金標準”，而全基因組測序技術能為分析病原的毒力基因、耐藥基因及分子溯源提供更多的病原學信息。全基因組測序技術還可以用于預測與毒力、生存壓力或微生物耐藥性相關的各種遺傳特征，這對改善食品安全管理和公眾健康有很大益處。