疏肝益腎活血湯對(duì)乳腺癌化療后臨床療效、卵巢損傷修復(fù)及BMP-15、miRNA-503表達(dá)的影響*

王敏,張夢(mèng)馨,黃輝,張靜知

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000

乳腺癌是當(dāng)今女性惡性腫瘤發(fā)病率最高的腫瘤類型之一,也是女性因癌癥死亡的主要原因之一。該病發(fā)病率逐年上升且日趨年輕化,且隨著年齡增加而上升[1]。目前,臨床認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生與乳腺疾病、精神壓力、月經(jīng)周期、產(chǎn)齡、產(chǎn)次等因素有關(guān)。早期乳腺癌患者以手術(shù)治療輔助放射治療;Ⅱ—Ⅲ期患者則主要以手術(shù)治療后根據(jù)患者臨床情況決定輔助化療或放療方案[2]。化療可清除手術(shù)后體內(nèi)參與的惡性腫瘤細(xì)胞,提高手術(shù)的治愈率。研究表明,乳腺癌化療可能導(dǎo)致卵巢功能損傷[3]。乳腺癌屬中醫(yī)“乳巖”“乳石癰”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為,本病的發(fā)病主要與脾腎虧虛、血虛肝郁有關(guān)。疏肝益腎活血湯以清代名醫(yī)高鼓峰的《醫(yī)宗己任編》卷一“疏肝益腎湯”為底方,經(jīng)過臨床多年應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌有較好的療效。本研究觀察疏肝益腎活血湯對(duì)乳腺癌化療后臨床療效、卵巢損傷修復(fù)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP-15)、miRNA-503表達(dá)的影響,并分析其發(fā)揮療效的作用機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取80例乳腺癌患者納入本次前瞻性研究,受試范圍為2019年6月至2021年6月在陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行統(tǒng)一化療的患者。所有患者按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和試驗(yàn)組各40例。對(duì)照組患者年齡20～40(22.45±7.55)歲;腫瘤分期:Ⅱ期18例,Ⅲ期22例;病理類型:浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌25例,浸潤(rùn)性小葉癌15例。試驗(yàn)組患者年齡20～42(22.52±8.48)歲;腫瘤分期:Ⅱ期14例,Ⅲ期26例;病理類型:浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌28例,浸潤(rùn)性小葉癌12例。兩組患者年齡、腫瘤分期、病理類型等一般資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性(P>0.05)。本研究經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審查通過(批號(hào):0019N-106)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 乳腺癌西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)乳腺癌診療指南2020》[4]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)并根據(jù)病理或細(xì)胞學(xué)確診為乳腺癌;經(jīng)美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)/美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)(CAP)發(fā)布的乳腺癌人類生長(zhǎng)因子受體-2檢測(cè)指南[5]確認(rèn)人類生長(zhǎng)因子受體-2陰性。

1.2.2 乳腺癌中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參考《腫瘤中醫(yī)診療指南》[6]“脾腎虧虛證”兼“血虛肝郁證”辨證要點(diǎn):乳房腫塊,倦怠乏力,腰膝酸軟或腰痛,食少納呆,肢體麻木,口淡不渴,肌膚甲錯(cuò),舌淡有齒痕或苔白、厚膩或舌質(zhì)紫黯有瘀點(diǎn)、瘀斑,脈沉細(xì)、澀。

1.3 病例納入標(biāo)準(zhǔn)(自擬)(1)經(jīng)病理組織學(xué)確診的女性乳腺癌患者,中醫(yī)辨證為肝腎陰虛證兼血瘀證;(2)年齡為20～42周歲、TNM病理分期為Ⅱ—Ⅲ期的患者;(3)預(yù)計(jì)生存期在6個(gè)月以上的患者;(4)雌激素受體(ER)和(或)孕激素受體(PR)陽性,人類生長(zhǎng)因子受體-2陰性患者;(5)KPS功能狀態(tài)評(píng)分大于60分的患者;(6)非中藥過敏體質(zhì)的患者;(7)簽署知情同意書的患者。

1.4 病例排除標(biāo)準(zhǔn)(自擬)(1)其他惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至乳腺的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者;(2)合并心臟、腦、肝臟、腎臟等嚴(yán)重原發(fā)病的患者;(3)月經(jīng)規(guī)律的患者;(4)參與治療前有激素類藥物用藥史的患者。

1.5 病例脫落標(biāo)準(zhǔn)(自擬)(1)主觀上不能按療程服藥或服藥依從性較差的患者;(2)不良反應(yīng)嚴(yán)重(指嚴(yán)重反應(yīng)但不危及生命而是延長(zhǎng)治療時(shí)間)的患者。

1.6 治療方法所有患者均行TE化療方案,具體用藥如下:多西紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer S.A.,X20010340,每支20 mg,0.5 mL)60 mg·m-2,第1天靜脈滴注;表柔比星[輝瑞制藥(無錫)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20000496,10 mg]60 mg·m-2,第1天靜脈推注。3周為1個(gè)化療周期,連續(xù)治療兩個(gè)周期。試驗(yàn)組在TE化療方案基礎(chǔ)上給予疏肝益腎活血湯,方藥組成:柴胡12 g,生黃芪30 g,山藥 15 g,枸杞子12 g,女貞子12 g,半枝蓮9 g,黨參 12 g,山慈菇9 g,白花蛇舌草15 g,白芍12 g,丹參 9 g,甘草6 g。以上藥物由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房統(tǒng)一制藥裝袋,每劑400 mL,早晚飯后分次溫服。3周為1個(gè)療程,連續(xù)服用兩個(gè)療程。

1.7 觀察指標(biāo)(1)觀察兩組患者治療后3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月的月經(jīng)狀態(tài)和月經(jīng)恢復(fù)時(shí)間。(2)采用流式細(xì)胞儀(Beckman公司)檢測(cè)兩組治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平。(3)采集兩組患者治療前后外周靜脈血并分離血清和血漿,低溫保存送檢。采用化學(xué)發(fā)光儀(Beckman公司)檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組血清血清雌二醇(estradiol,E2)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP-15)水平。(4)采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定兩組治療前,治療后3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月的血清卵巢抗繆勒管激素(ovarian anti Mullerian hormone,AMH)水平。(5)采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定兩組治療前后血漿miRNA-503表達(dá),步驟嚴(yán)格按照RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增進(jìn)行,miRNA試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司,熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司,引物合成于上海生工生物工程有限公司,序列如下:miRNA-503上游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,miRNA-503下游引物5′-GCTAGCAGCGGGAACAG-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。(6)觀察兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況,包括胃腸道反應(yīng)、血小板減少、粒細(xì)胞減少、肝腎功能損害等。

1.8 臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估兩組患者療程結(jié)束后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況[7]。完全緩解(complete remission,CR):可測(cè)量病灶全部消失;部分緩解(partial remission,PR):可測(cè)量病灶直徑之和減少超過30%;疾病穩(wěn)定(stable disease,SD):可測(cè)量病灶直徑之和增加未到PD標(biāo)準(zhǔn)或減少未到PR標(biāo)準(zhǔn);疾病進(jìn)展(progressive disease,PD):可測(cè)量病灶直徑之和增加>20%。

有效率=(CR+PR)/n×100%

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床療效比較試驗(yàn)組有效率(57.50%)明顯高于同期對(duì)照組(30.00%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組患者臨床療效比較 例

2.2 兩組患者不同時(shí)間月經(jīng)狀態(tài)比較治療后3個(gè)月,兩組患者閉經(jīng)人數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后6個(gè)月和治療后12個(gè)月,試驗(yàn)組閉經(jīng)人數(shù)均少于同期對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);試驗(yàn)組月經(jīng)恢復(fù)時(shí)間短于對(duì)照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組患者不同時(shí)間月經(jīng)狀態(tài)比較

2.3 兩組患者治療前后免疫功能比較治療后,兩組患者CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平均顯著高于治療前(P<0.05),試驗(yàn)組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平顯著高于同期對(duì)照組(P<0.05),治療后兩組患者CD8+顯著低于治療前(P<0.05),試驗(yàn)組CD8+顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組患者治療前后免疫功能比較

2.4 兩組患者治療前后E2、FSH、LH水平比較治療后,兩組患者血清FSH、LH水平顯著高于治療前(P<0.05),試驗(yàn)組血清FSH、LH水平顯著高于同期對(duì)照組(P<0.05);兩組患者血清E2水平顯著低于治療前(P<0.05),試驗(yàn)組血清E2水平顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05),見表4。

表4 兩組患者治療前后E2、FSH、LH水平比較

2.5 兩組患者治療前后BMP-15、AMH水平及miRNA-503表達(dá)比較治療后,兩組患者BMP-15、和miRNA-503水平顯著低于治療前(P<0.05),試驗(yàn)組BMP-15、miRNA-503水平顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05);治療前和治療后3個(gè)月,對(duì)照組和試驗(yàn)組AMH水平無明顯差異(P>0.05),治療后6個(gè)月和治療后12個(gè)月試驗(yàn)組AMH水平顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05),見表5、表6。

表5 兩組患者治療前后BMP-15水平、miRNA-503表達(dá)比較

表6 兩組患者不同時(shí)間AMH水平比較

2.6 兩組患者不良反應(yīng)比較治療期間對(duì)照組胃腸道反應(yīng)9例,血小板減少5例,粒細(xì)胞減少7例,肝功能損傷2例;試驗(yàn)組胃腸道反應(yīng)6例,血小板減少3例,粒細(xì)胞減少4例,肝功能損傷1例,腎功能損傷1例。所有患者不良反應(yīng)均不嚴(yán)重,經(jīng)對(duì)癥治療后緩解。

3 討論

化療是乳腺癌術(shù)后主要的治療方式,但化療藥物對(duì)正常卵母生殖細(xì)胞的無差別損傷可導(dǎo)致卵巢功能減退。中醫(yī)療法具有療效安全、溫和的特色,有助于提高患者免疫功能,因此,在乳腺癌術(shù)后化療的輔助治療中具有獨(dú)特作用。

乳腺癌屬中醫(yī)“乳巖”“乳石癰”等范疇。《諸病源候論》言:“石癰之狀,微強(qiáng)不甚大,不赤微痛熱……但結(jié)核如石。”《婦人大全良方》則描述乳巖“若初起內(nèi)結(jié)小核,或如鱉棋子,不赤不痛,積之歲月,漸大如巉巖……此屬肝脾欲怒,氣血虧損”,認(rèn)為本病的發(fā)生與肝郁、血瘀有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為,肝與乳房密切相關(guān)。《醫(yī)學(xué)入門》記載“肝腎不足,沖任失調(diào)”,情志不暢,肝失條達(dá),氣血不暢則腎陽不足,脾失健運(yùn),難以蒸騰運(yùn)化水濕,水飲凝聚成痰,日久則由氣血痰瘀互結(jié)形成乳巖。此外,由于后天手術(shù)、化療等治療對(duì)患者進(jìn)一步耗損氣血,導(dǎo)致氣血生化無源,進(jìn)一步虧虛。正氣不足,肝腎虧虛,邪氣阻滯,痰瘀凝滯,均為本病發(fā)生的重要因素。因此,扶正固本、疏肝益腎、調(diào)節(jié)臟腑、活血化瘀對(duì)于乳腺癌的治療具有重要意義[8-9]。

疏肝益腎活血湯是陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院治療乳腺癌多年的經(jīng)驗(yàn)方,對(duì)乳腺癌有較好的療效。方中柴胡、白芍為君藥,柴胡疏肝解郁,白芍養(yǎng)肝斂陰,二藥一散一收,配伍后既養(yǎng)肝體又養(yǎng)肝用;生黃芪、山藥、黨參、丹參為臣,其中生黃芪補(bǔ)益元?dú)?配伍山藥健脾益氣,以補(bǔ)正氣不足,黨參、丹參行氣活血、逐瘀生新;佐之枸杞子、女貞子滋補(bǔ)肝腎,白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒,山慈菇抗癌散結(jié);甘草為使,可調(diào)和諸藥藥性。全方共奏疏肝益腎、補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱解毒、活血散結(jié)之功。王宇等[10]發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草可顯著抑制腫瘤細(xì)胞G0和G1期的增殖活動(dòng),且具有明顯的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,這一作用存在顯著的“量-效”關(guān)系。杜江洋等[11]發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草配伍半枝蓮呈濃度依賴性提高周期抑制蛋白p21的表達(dá)水平,抑制PCNA的表達(dá),抑制p38、JNK、ERK的磷酸化水平,提高VASP在Ser157和Ser239位點(diǎn)的磷酸化,部分通過cAMP/cGMP和抑制MAPK信號(hào)通路而誘導(dǎo)MDA-MB-231的凋亡,發(fā)揮抗乳腺癌的作用。楊楠等[12]發(fā)現(xiàn),柴胡皂苷D可通過降低HIF-1、VEGF蛋白的表達(dá)和升高IGFBP-6蛋白的表達(dá)抑制人三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖。

本研究結(jié)果表明,試驗(yàn)組有效率(57.50%)明顯高于同期對(duì)照組(30.00%),說明疏肝益腎活血湯對(duì)乳腺癌化療后腫瘤抑制效果較好。治療后,試驗(yàn)組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平顯著高于同期對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)組CD8+顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05),說明疏肝益腎活血湯可提高機(jī)體免疫水平,原因可能在于黃芪皂苷Ⅱ可能通過激活CD45蛋白酪氨酸磷酸酯酶介導(dǎo)Th1淋巴細(xì)胞克隆性增殖、活化及Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化效應(yīng),進(jìn)而改善機(jī)體免疫功能[13]。雌激素是反映女性內(nèi)分泌水平的重要指標(biāo)。E2分泌過高,同時(shí)FSH、LH分泌減少說明乳腺上皮細(xì)胞以及纖維組織增生活性強(qiáng),存在更高的乳腺癌變風(fēng)險(xiǎn)[14]。治療后,試驗(yàn)組血清FSH、LH水平顯著高于同期對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)組血清E2水平顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05),說明疏肝益腎活血湯可改善雌激素分泌情況。孫婉娟等[15]研究報(bào)道,藏黨參正丁醇萃取物有助于降低大鼠血清E2水平,提高FSH、LH以及孕酮水平,同時(shí)可改善大鼠體內(nèi)抗氧化活性,與本次研究結(jié)果一致,反映了疏肝益腎活血湯對(duì)血清性激素以及內(nèi)分泌激素具有一定的調(diào)節(jié)作用。

化療藥物的應(yīng)用可能會(huì)導(dǎo)致卵巢功能損傷,原因在于化療藥物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)不可避免地導(dǎo)致正常卵母細(xì)胞死亡,直接導(dǎo)致生殖細(xì)胞丟失以及卵巢早衰[16-18]。劉思旋等[19]發(fā)現(xiàn),環(huán)磷酰胺輔助化療方案可明顯減少小鼠卵巢卵泡數(shù)量,并降低患者血清AMH水平,且年齡越大卵巢的不可逆性損傷程度越嚴(yán)重。這是由于環(huán)磷酰胺的活性代謝物可與谷胱甘肽結(jié)合,從而增加氧化應(yīng)激并處罰卵巢細(xì)胞凋亡效應(yīng),其他的化療藥物也有類似的效應(yīng),產(chǎn)生細(xì)胞抑制藥效的同時(shí)破壞了卵母細(xì)胞的DNA,例如雙鏈DNA斷裂,以致觸發(fā)凋亡[20]。AMH是反映卵巢儲(chǔ)備功能的生物標(biāo)志物之一,這是由于直徑>8 mm的卵泡幾乎不分泌AMH,因此,AMH分泌量過高提示了機(jī)體內(nèi)大部分為直徑<4 mm 的小竇卵泡[21]。BMP-15在卵母細(xì)胞中表達(dá),可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖并通過抑制顆粒細(xì)胞表面FSHR的表達(dá)來選擇優(yōu)勢(shì)卵泡,阻止孕酮生成并抑制卵母細(xì)胞正常生長(zhǎng)[22-23]。miRNA-503則可通過抑制血管生成影響卵巢動(dòng)脈的血流灌注,血流灌注降低則無法為卵泡的成熟提供循環(huán)支持,從而導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能下降[24]。治療后,實(shí)驗(yàn)組 BMP-15、AMH和miRNA-503水平顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05),說明,疏肝益腎活血湯有助于抵抗并減輕化療帶來的卵巢損傷。

綜上所述,疏肝益腎活血湯對(duì)乳腺癌化療后腫瘤抑制效果較好,有助于提高機(jī)體免疫水平,改善雌激素分泌情況,抵抗并減輕化療帶來的卵巢損傷。但本次研究受限于研究觀察時(shí)間和樣本數(shù)量,觀察結(jié)果僅能作為一種治療方式的參考,未來研究中仍需通過擴(kuò)大病例樣本數(shù)量、延長(zhǎng)隨訪時(shí)間等方式觀察其對(duì)患者的遠(yuǎn)期影響。