牛膝甾酮抑制miR-98-5p促進激素性股骨頭壞死大鼠BMSC自噬及成骨分化*

武瑞臣,崔書偉,李雙慶

1.邯鄲中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056000; 2.冀中能源峰峰集團總醫(yī)院邯鄲院區(qū),河北 邯鄲 056000;3.滄州市中心醫(yī)院,河北 滄州 061000

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是臨床常見骨科疾病,多發(fā)于20～50歲青中年,發(fā)病隱匿且進展極快,臨床表現(xiàn)為髖部及腹股溝疼痛[1]。激素類藥物因其較強的抗炎及免疫抑制作用,被廣泛應用于多種疾病的臨床治療,但會導致機體代謝紊亂、痤瘡、多毛、高血壓、骨質疏松等副作用的出現(xiàn),其中激素性股骨頭壞死(steroid induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)是其最嚴重的副作用之一。我國是SONFH發(fā)病大國,因濫用激素引發(fā)的SONFH占ONFH 25%以上[2]。目前,治療SONFH方式多樣,通常采用口服抗凝及抗骨質疏松藥物、中藥敷貼及手術髓芯加壓治療,但治療周期長、療效欠佳、治療費用過高[3]。牛膝甾酮是從傳統(tǒng)中藥牛膝中提取的甾酮類物質,具有抗炎、抗病毒、調節(jié)機體免疫、延緩衰老等多種生物醫(yī)學功能[4]。研究表明,牛膝甾酮可提高軟骨細胞增殖活性,從而治療骨關節(jié)炎[5]。然而,目前關于牛膝甾酮用于SONFH治療的報道甚少。本研究通過建立SONFH大鼠模型,觀察牛膝甾酮對SONFH大鼠骨髓間充質干細胞(bone manrrow mesenchymal stemcells,BMSC)自噬及成骨分化的影響,以期為臨床應用提供實驗基礎。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠10只,雄性,6周齡,體質量(200±20) g,購自上海茂生衍生物科技有限公司,生產許可:SCXK(滬)2017-0004。大鼠購入后于通風環(huán)境中飼養(yǎng),保持溫度(24±2) ℃、相對濕度50%～60%,給予充足飲水和飼料,12 h/12 h 光照黑暗交替,適應性飼養(yǎng)1周。本研究經邯鄲中心醫(yī)院動物倫理委員會審批通過。

1.2 藥物與試劑醋酸潑尼松龍注射液(華中藥業(yè)股份有限公司,國藥準字H42021216,規(guī)格:0.125 g);牛膝甾酮(純度≥98%,上海澤葉生物科技有限公司);LipofectamineTM3000試劑(美國invitrogen公司,貨號:L3000008);miR-98-5p mimics及其陰性對照(negative control,NC)(上海拓然生物科技有限公司);雙熒光素酶檢測試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司,貨號:LM130595-100);2×SYBR Green PCR Mastermix和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:SR1110、 PC0020);茜素紅染色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,貨號:KFS128);兔抗大鼠CD29、CD34、CD45、CD44、Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interaction protein 1,CKIP-1)一抗(美國genetex公司,貨號:GTX128839、GTX02602、GTX65913、GTX102111、GTX31722、GTX00949、GTX85240)。

1.3 儀器Synergy-HD型顯微鏡(日本Toshiba公司);CytoFLEX型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司);Stepone 型實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)儀(美國ABI公司);Infinite F50 型酶標儀(瑞士Tecan公司);WD-9413A型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 建立激素性股骨頭壞死模型取10只SD大鼠,按文獻記載的方法建立激素性股骨頭壞死模型[6],具體如下:以10 μg·kg-1的劑量給予大鼠尾靜脈注射內毒素,24 h后以20 mg·kg-1的劑量腹腔注射醋酸潑尼松龍注射液,每日1次,持續(xù)3 d。造模結束后,采用磁共振成像技術檢查大鼠股骨頭,觀察到股骨頭內出現(xiàn)嚴重水腫則表明造模成功。

2.2 BMSCs的提取及鑒定建模成功的大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉,脫頸處死后無菌環(huán)境下切取雙側股骨及脛骨,注射器沖出骨髓,獲取骨髓細胞懸液,去除雜質后置于離心機,1 000 r·min-1離心 5 min(離心半徑8 cm),棄上清,采用α-MEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗)于37 ℃,5%CO2條件下培養(yǎng),培養(yǎng)3 d后換液,待細胞融合至80%,胰酶消化傳代,取第3代BMSC,胰酶消化后離心,PBS沖洗后重懸細胞,調整細胞密度為1×106mL-1,注入無菌管內,加入CD29、CD34、CD45、CD44一抗(12 000),4 ℃避光孵育20 min,PBS沖洗后重懸細胞,經流式細胞儀分析CD29、CD34、CD45、CD44的表達。

2.3 細胞分組與干預方式取第3代BMSC,胰酶消化后離心,PBS沖洗后重懸細胞,調整細胞密度為1×106mL-1,接種至6孔板,根據LipofectamineTM3000試劑盒說明書操作,將miR-98-5p過表達質粒miR-98-5p mimics轉染至BMSC,轉染48 h后分為轉染組、牛膝甾酮聯(lián)合轉染組,轉染組細胞置于α-MEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),牛膝甾酮聯(lián)合轉染組細胞培養(yǎng)基中需另外加入牛膝甾酮,使其終濃度為10 mg·L-1[7],繼續(xù)培養(yǎng)48 h。另取第3代BMSC分為對照組、牛膝甾酮組,對照組置于α-MEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),牛膝甾酮組細胞培養(yǎng)基中需另外加入牛膝甾酮,使其終濃度為10 mg·L-1。每組均設置5個復孔,培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗。

2.4 qRT-PCR檢測轉染后各組細胞miR-98-5p mRNA表達情況取2.3項中培養(yǎng)48 h后的各組細胞,PBS沖洗,采用Trizol法提取總RNA,逆轉錄為cDNA,以U6為內參定量檢測miR-98-5p的表達,根據試劑盒說明書要求配制反應體系:雙倍核酸染料12 μL,無菌雙蒸水4 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,模板cDNA 2 μL,總體積20 μL。擴增條件:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,重復40個循環(huán)。實驗所用引物:miR-98-5p Forward primer 5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′;Reverse primer 5′-TGCTTGAGGTAGTAAGTTG-3′;U6 Forward primer 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;Reverse primer 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2.5 Western blot法檢測細胞Beclin1、LC3Ⅱ、CKIP-1蛋白表達量取2.4項中培養(yǎng)48 h后的各組細胞,PBS沖洗,加入RIPA裂解液,置于離心管內,8 000 r·min-1離心20 min(離心半徑8 cm),收集沉淀物,采用BCA試劑盒定量蛋白。取50 μg待測樣本,以體積比15與上樣緩沖液混合,100 ℃ 水浴5 min變性蛋白,同條件離心,取其上清液,恒壓下行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,濕法轉至硝酸纖維素膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,TBST洗膜,加入兔抗大鼠Beclin1、LC3Ⅱ、CKIP-1一抗(稀釋比例1500),4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗膜,加入二抗(稀釋比例12 000),常溫孵育2 h,加入ECL發(fā)光液顯色,置于暗室曝光,經凝膠成像系統(tǒng)分析,以Beclin1、LC3Ⅱ、CKIP-1蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值比值表示Beclin1、LC3Ⅱ、CKIP-1蛋白表達量。

2.6 對硝基苯磷酸鹽法檢測堿性磷酸酶(phosphatase alkaline,ALP)活性取2.3項中培養(yǎng)48 h后的各組細胞,胰酶消化后離心,PBS沖洗后重懸細胞,調整細胞密度為1×106mL-1,接種至96孔板,各孔均加入α-MEM培養(yǎng)基200 μL,待細胞融合至80%,更換為成骨誘導培養(yǎng)基,2周后加入對硝基苯磷酸鹽反應液(每孔100 μL),37 ℃孵育20 min,每孔加入0.2 mol·L-1氫氧化鈉終止液50 μL,經酶標儀測定405 nm處吸光度值。

2.7 茜素紅染色法檢測鈣化結節(jié)面積占比取2.3項中培養(yǎng)48 h后的各組細胞,加入成骨誘導液,待顯微鏡下可見黃褐色鈣化結節(jié),成骨誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周,棄去培養(yǎng)液,PBS沖洗,無水乙醇固定20 min,加入茜素紅染液常溫下染色30 min,PBS沖洗,置于顯微鏡下觀察鈣化結節(jié)形成情況,隨機選取5個不重復的視野,使用Image Pro軟件處理圖片,計算鈣化結節(jié)面積平均占比。

2.8 雙熒光素酶實驗驗證miR-98-5p與CKIP-1的靶向關系TargetScan預測CKIP-1 3′UTR可能與miR-98-5p結合的潛在位點,上海經科化學科技有限公司對其進行鑒定。構建合成CKIP-1野生型和突變型3′UTR,分別為CKIP-1 3′-UTR-WT、CKIP-1 3′-UTR-MT,并將其插入雙熒光素酶載體,與miR-98-5p質粒(miR-98-5p mimic、miR-98-5p mimic-NC)共轉染至293T細胞,分為CKIP-1 3′-UTR-WT+miR-98-5p mimic-NC組、CKIP-1 3′-UTR-WT組+miR-98-5p mimic組、CKIP-1 3′-UTR-MT+miR-98-5p mimic-NC組、CKIP-1 3′-UTR-MT組+miR-98-5p mimic組。24 h后收集細胞,經雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性,螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性=目標相對熒光素酶活性。

3 結果

3.1 BMSC形態(tài)觀察、表面特異性標志物鑒定經顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),第3代BMSC形態(tài)呈三角形、梭形、扇形、圓形,胞漿豐富,排列有序;傳代后細胞生長旺盛,增殖較快,第7天融合度達80%,梭形生長。經流式細胞儀檢測,BMSCs表面CD29、CD44表達率均超過95%,CD34、CD45為陰性表達,表明培養(yǎng)的細胞為BMSCs。

3.2 轉染后各組miR-98-5p表達量比較與對照組比較,牛膝甾酮組miR-98-5p表達量顯著降低(P<0.05),轉染組miR-98-5p表達量顯著升高(P<0.05);與牛膝甾酮組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組miR-98-5p表達量顯著升高(P<0.05);與轉染組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組miR-98-5p表達量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-98-5p表達量比較

3.3 BMSC自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ表達量比較與對照組比較,牛膝甾酮組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達量顯著升高(P<0.05),轉染組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達量顯著降低(P<0.05);與牛膝甾酮組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達量顯著降低(P<0.05);與轉染組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 各組細胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白條帶圖

表2 各組細胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達量比較

3.4 各組細胞ALP活性比較與對照組比較,牛膝甾酮組ALP活性顯著升高,轉染組ALP活性顯著降低(P<0.05);與牛膝甾酮組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組ALP活性顯著降低(P<0.05);與轉染組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組ALP活性顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 雙熒光素酶實驗結果比較

表3 各組細胞ALP活性比較

3.5 各組細胞鈣化結節(jié)面積占比比較與對照組比較,牛膝甾酮組鈣化結節(jié)面積占比顯著升高(P<0.05),轉染組鈣化結節(jié)面積占比顯著降低(P<0.05);與牛膝甾酮組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組鈣化結節(jié)面積占比顯著降低(P<0.05);與轉染組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組鈣化結節(jié)面積占比顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注:A:對照組;B:牛膝甾酮組;C:轉染組;D:牛膝甾酮聯(lián)合轉染組

3.6 雙熒光素酶實驗結果雙熒光素酶結果顯示,與CKIP-1 3′-UTR-WT+miR-98-5p mimic組比較,CKIP-1 3′-UTR-WT+miR-98-5p mimic-NC組、CKIP-1 3′-UTR-MT+NC mimic組、CKIP-1 3′-UTR-MT組+miR-98-5p mimic組熒光素酶活性值顯著升高(P<0.05);CKIP-1 3′-UTR-WT+miR-98-5p mimic-NC組、CKIP-1 3′-UTR-MT+miR-98-5p mimic-NC組、CKIP-1 3′-UTR-MT組+miR-98-5p mimic組3組熒光素酶活性值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),推測CKIP-1是miR-98-5p的一個靶基因,兩者結合位點為CKIP-1的3′-UTR片段。見圖3,表3。

圖3 雙熒光素酶實驗結果

3.7 各組細胞CKIP-1蛋白表達量比較與對照組比較,牛膝甾酮組CKIP-1蛋白表達量顯著降低,轉染組CKIP-1蛋白表達量顯著升高(P<0.05);與牛膝甾酮組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組CKIP-1蛋白表達量顯著升高(P<0.05);與轉染組比較,牛膝甾酮聯(lián)合轉染組CKIP-1蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見圖4,表4。

圖4 各組細胞CKIP-1蛋白條帶圖

表4 各組細胞CKIP-1蛋白表達量比較

4 討論

SONFH是因長期或大量應用激素類藥物造成股骨頭血液循環(huán)障礙,引起的髖關節(jié)障礙疾病,早期表現(xiàn)為股骨頭廣泛性骨質疏松、骨小梁中斷,后發(fā)展為股骨頭塌陷、關節(jié)間隙變窄、股骨頭缺血性壞死,引發(fā)嚴重髖關節(jié)炎,致殘率居高不下[8-11]。目前國內外對SONFH發(fā)病機制的研究尚無突破性進展,骨細胞凋亡、脂肪栓塞、凝血機制改變、骨內高壓等均是其可能機制[12-14]。近年來,新研究結果表明,SONFH的發(fā)生可能與激素抑制BMSC成骨分化及自噬功能有關,在激素的作用下,BMSC發(fā)生衰老,傳代及成骨分化能力下降,打破股骨頭內破骨-成骨動態(tài)平衡,大量分化為脂肪細胞,造成脂肪堆積,同時BMSC保護性自噬功能降低,細胞大面積凋亡,破壞股骨頭內骨結構,從而發(fā)病[15-17]。因此,探尋提高BMSC自噬功能及成骨分化能力的新型治療方式,對于改善患者預后、降低致殘率具有積極意義。

ALP是促進骨形成的重要磷酸酶,可提升骨基質鈣、磷濃度,促進其鈣化成熟,其活性越強代表成骨分化能力越強,可作為成骨細胞早期分化指標[18]。鈣化結節(jié)是鈣鹽沉淀產物,是成骨的早期階段,是判定成骨細胞分化完成的重要標志[19]。中醫(yī)將SONFH歸入“骨蝕”“骨痹”范疇,其主要病機為肝腎虛虧、陽氣不足,以致腰脊不舉、骨枯髓減,進而發(fā)病,激素為辛溫燥熱之物,壯火食氣、陽邪過盛、傷津耗氣,以致腎陽虛衰、脈絡血瘀,故而治療上應以補腎益肝,活血化瘀為主[20-21]。中藥牛膝取自莧科植物牛膝的干燥根,性平,味苦、酸,歸肝經、腎經,可補肝腎,強筋骨,逐瘀通經,漢末《名醫(yī)別錄》記載,牛膝可治療傷中少氣、男腎陰消、老人失溺、補中續(xù)絕、填骨髓、除腦中痛及腰脊痛[22]。牛膝甾酮是牛膝主要活性物質之一,可促進成骨細胞增殖、分化[23]。本研究結果顯示,與對照組比較,牛膝甾酮組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達量、ALP活性、鈣化結節(jié)面積占比升高,提示牛膝甾酮可提升BMSC自噬功能及成骨分化能力。

miRNA是機體內一種小型內生非編碼RNA,可通過與mRNA非翻譯區(qū)堿基互補配對,抑制轉錄及蛋白質翻譯,從而調控基因表達,在多種疾病發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色[24]。鄭峰等[25]研究發(fā)現(xiàn),干擾miR-98-5p可通過激活下游基因促進成骨細胞增殖、分化。CKIP-1是成骨分化重要調控因子,廣泛存在于大腦組織、心肌組織、骨組織及BMSC、免疫細胞中,在細胞增殖、分化、凋亡過程中發(fā)揮重要作用,可通過蛋白酶體降解途徑,加速骨相關蛋白降解,參與骨發(fā)育、骨再生過程,起到負向調控作用[26-27]。Huang等[28]研究認為,低表達CKIP-1可提升間充質細胞增殖及成骨分化能力,提示CKIP-1在成骨分化方面的作用。本研究經雙熒光素酶實驗驗證,miR-98-5p與CKIP-1存在結合位點,CKIP-1是其靶向調控基因之一。此外,本研究結果顯示,與對照組比較,轉染組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達量、ALP活性、鈣化結節(jié)面積占比降低,CKIP-1蛋白表達升高,且轉染后對牛膝甾酮的成骨促進作用有所影響,提示miR-98-5p在SONFH大鼠BMSC中高表達,牛膝甾酮可能通過抑制miR-98-5p從而下調CKIP-1促進BMSC自噬及成骨分化。

綜上所述,牛膝甾酮可促進SONFH大鼠BMSC自噬及成骨分化,其作用機制可能與抑制miR-98-5p從而下調CKIP-1表達有關。