血府逐瘀膠囊調控miR-532-5p/Arp2抑制ox-LDL誘導的人冠狀動脈內皮細胞氧化應激損傷*

李江,趙建廷,呂昌光,金一琦

南京醫科大學附屬蘇州醫院,江蘇 蘇州 215000

動脈硬化閉塞癥是發病率最高的缺血性疾病之一,近年來其發病率逐年增加,此疾病最主要為下肢動脈硬化閉塞,其中30%發生于髂動脈,70%多見于股動脈、腘動脈及遠端動脈等[1],在中醫學中屬于“脫疽”范疇。動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是引起動脈硬化閉塞癥的主要原因[2-3]。由氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)引起的內皮細胞功能障礙是AS發生的第一步。ox-LDL可破壞血管內皮細胞的氧化還原平衡,引起氧化應激損傷[4-5]。血府逐瘀湯是清代王清任《醫林改錯》中治療血瘀的一個經典方劑,由桃仁、紅花、生地黃、當歸、赤芍、川芎、柴胡、枳殼、牛膝、桔梗、甘草11味中藥組成,方劑中的桃仁、紅花、生地黃、當歸、赤芍、川芎6味藥活血化瘀而養血;柴胡、枳殼、甘草行氣和血而舒肝;桔梗可以開肺氣、載藥上行,配合枳殼則升降上焦之氣而寬胸;牛膝通利血脈、引血下行。臨床上發現此方劑可改善微循環、擴張微血管、增加組織灌注,被廣泛用于包括AS在內的多種疾病的治療[6-7]。臨床研究發現,血府逐瘀湯可明顯改善下肢動脈硬化閉塞癥患者的癥狀[8],但是其作用機制尚未完全闡明。

微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類長度為22～25個核苷酸的非編碼RNAs。miRNAs是AS發生和發展過程的一類重要的調控因子[9-11]。最新的研究發現,血府逐瘀湯在顱腦損傷中發揮神經保護作用與miRNAs表達變化有關[12]。Sun等[13]的研究顯示,miR-532-5p在AS患者血清中的表達水平比健康人低,且miR-532-5p低表達在 ox-LDL誘導的內皮細胞損傷中發揮重要作用[14]。故本實驗檢測血府逐瘀膠囊對下肢動脈硬化閉塞癥患者血清中miR-532-5p表達的影響,并用ox-LDL誘導的人冠狀動脈內皮細胞(human coronary artery endothelial cells,HCAECs)氧化應激損傷模型探究血府逐瘀膠囊含藥血清對內皮細胞氧化損傷的作用并探討其與miR-532-5p的關系。

1 材料

1.1 臨床資料選擇2021年1月至2022年5月在南京醫科大學附屬蘇州醫院經超聲檢查或血管造影等影像學檢查確診為下肢動脈硬化閉塞癥并采用保守治療的患者40例,其中男性26例,女性14例,年齡49～73歲,平均年齡61.7歲。所有患者均符合中國中西醫結合學會制定的診斷標準,Fontaine分期為Ⅰ—Ⅲ期。排除標準:(1)具有嚴重的疾病病史,如血液病、惡性腫瘤、心肌梗死、嚴重肝腎功能異常、腦出血、自身免疫疾病;(2)精神異常、伴有嚴重肢體感染、具有傳染性疾病;(3)肢體缺血性疾病,如大動脈炎、血栓閉塞性脈管炎;(4)患者依從性差。本研究經南京醫科大學附屬蘇州醫院倫理委員會批準(批號:2020-024),且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗動物與細胞6周齡SD大鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供,動物許可證號:SCXK(滬)2012-0002。大鼠飼養在蘇州大學實驗動物中心,溫度(22±1) ℃,濕度(60±5)%,12 h/12 h晝夜交替,可自由進食飲水。適應飼養一周后進行實驗。所有動物實驗操作均經蘇州大學實驗動物倫理委員會審查批準(批號:2021-019)。HCAECs細胞(美國ATCC公司,貨號:PCS-100-020)。

1.3 藥物與試劑血府逐瘀膠囊(天津宏仁堂藥業有限公司,批號:Z12020223);內皮細胞培養基(美國Sciencell公司,貨號:1001);胎牛血清(美國Hyclone公司,貨號:SH30396.02);Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司,貨號:L3000008);ox-LDL、RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:IO1300、R0010、PC0020);丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒(微板法)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒(WST-1 法)(南京建成生物工程研究所,貨號:A003-4-1、A001-3-2);活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒和CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:S0033S、C0038);TRNzol Universal總RNA提取試劑、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司,貨號:DP424、KR211、FP411);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司,貨號:E1910);肌動蛋白相關蛋白2(actin-related protein 2,Arp2)兔單克隆抗體和GAPDH兔單克隆抗體(美國Abcam公司,貨號:ab128934、ab181602);Annexin V-APC/PI凋亡試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,貨號:E-CK-A217)。

1.4 儀器FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司);7500 Fast RT-PCR儀(美國ABI公司);NanoDrop 2000C超微量分光光度計和MultiskanTMFC 酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Tanon 4600 全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 治療方法和血清收集將40例患者隨機分成治療組和對照組,每組20例。對照組患者入院后給予常規治療,治療組患者入院后在給予常規治療的基礎上口服血府逐瘀膠囊,每日兩次,每次6粒。治療前和服藥4周后分別收集患者空腹靜脈血5 mL,靜置30 min后,3 000 r·min-1離心10 min,收集上清液即為血清樣本。

2.2 血府逐瘀含藥血清制備將大鼠隨機分成血府逐瘀膠囊組和對照組,每組5只。血府逐瘀膠囊組大鼠灌胃給予0.48 g·kg-1血府逐瘀膠囊藥液,給藥體積10 mL·kg-1,每天2次[15],對照組大鼠給予同等劑量的生理鹽水,連續7 d。末次給藥2 h后腹主動脈采血,靜置30 min后,4 ℃,3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,56 ℃水浴30 min滅活補體,0.22 μm微膜過濾除菌后,-70 ℃凍存備用。

2.3 細胞培養和分組將HCAECs培養在含有5%胎牛血清的內皮細胞培養基中,置于細胞培養箱中培養(條件設置為37 ℃,5%CO2)。取對數生長期的細胞,胰蛋白酶消化后接種到細胞培養皿中,過夜培養后,將細胞進行以下分組:對照組、ox-LDL組(加入100 mg·L-1ox-LDL培養24 h)、血府逐瘀組(用體積分數2.5%血府逐瘀含藥血清培養 48 h 后加入100 mg·L-1ox-LDL培養24 h)、血府逐瘀對照組(加入等量對照血清培養48 h后加入100 mg·L-1ox-LDL培養24 h)、血府逐瘀+miR-532-5p抑制劑組(用Lipofectamine 3000將miR-532-5p抑制劑轉染至細胞24 h后加體積分數2.5%血府逐瘀含藥血清培養48 h再用 100 mg·L-1ox-LDL繼續培養24 h)、血府逐瘀+miR-532-5p抑制劑對照組(用Lipofectamine 3000將miR-532-5p抑制劑對照轉染至細胞24 h后加入體積分數2.5%血府逐瘀含藥血清培養48 h再用100 mg·L-1ox-LDL繼續培養24 h)。

2.4 CCK-8測定細胞活力將2×103個HCAECs接種到96孔板,根據上述分組進行處理后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃,5%CO2細胞培養箱中孵育1 h,使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。

2.5 ROS、MDA和SOD含量檢測細胞內ROS水平根據DCFH-DA方法使用ROS檢測試劑盒進行測定。將HCAECs接種到6孔板,分為對照組、ox-LDL組、血府逐瘀組和血府逐瘀對照組,按2.3項所述方法進行處理后,去除細胞培養基,加入1 mL 10 μmol·L-1DCFH-DA,在37 ℃細胞培養箱中孵育20 min,無血清的細胞培養液清洗細胞去除未進入胞內的DCFH-DA。收集細胞,調整細胞密度為1×106mL-1,用流式細胞儀檢測熒光變化情況(488 nm激發波長,525 nm發射波長)。對于胞內MDA和SOD含量的檢測:HCAECs分組處理后,棄上清液,細胞刮刀將細胞刮下后用移液器轉移至微量離心管中,按照試劑盒說明書操作,用酶標儀分別在530 nm和450 nm波長處測定吸光度。

2.6 RT-PCR實驗根據TRNzol Universal總RNA提取試劑說明書操作提取患者血清和HCAECs的總RNA,取1 μg進行逆轉錄后取1 μL cDNA使用miRNA熒光定量檢測試劑盒在PCR儀上操作檢測miR-532-5p的表達。反應程序:95 ℃預變性15 min,94 ℃變性20 s,60 ℃退火延伸30 s,40個循環。用U6做內參,按照2-△△Ct計算miR-532-5p的表達量。引物序列如下:miR-532-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGCATGCCTTGAGTGTAG-3′,下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2.7 Western blot實驗HCAECs細胞分組處理后用RIPA裂解液裂解,提取總蛋白后,測定總蛋白濃度。每個樣本取20 μg進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,之后將樣本轉移到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入提前稀釋好的Arp2抗體(11 000)和GAPDH抗體(11 000)在4 ℃過夜孵育。將膜用TBST緩沖液洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(15 000)孵育1 h。用ECL發光液對蛋白顯色,拍照后用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。以GAPDH作為內參蛋白,計算Arp2蛋白的相對表達量。

2.8 細胞凋亡檢測將HCAECs接種到6孔板,分組處理后,收集上清液中懸浮細胞,用不含EDTA的胰酶消化細胞后收集細胞。PBS洗滌上述細胞后重懸細胞計數。取1×105個重懸細胞,300 r·min-1離心5 min,棄上清后用500 μL 1×Annexin V Binding Buffer將細胞重懸,然后加入5 μL Annexin V-APC試劑和5 μL PI試劑,混勻后室溫避光孵育 15 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.9 雙熒光素酶報告基因檢測miR-532-5p與Arp2的結合能力Starbase軟件預測miR-532-5p的靶基因,發現Arp2是它的一個潛在靶基因。將Arp2-3′UTR和突變的Arp2-3′UTR插入pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體中構建Arp2-Wt和Arp2-Mut質粒。將HCAECs接種到24孔板中,進行以下分組處理:miR-532-5p組(用Lipofectamine 3000轉染miR-532-5p和構建的Arp2-Wt或Arp2-Mut質粒)和miR-NC組(用Lipofectamine 3000轉染miR-532-5p對照品miR-NC和構建的Arp2-Wt或Arp2-Mut質粒)。48 h后測定熒光素酶活性。

3 結果

3.1 血府逐瘀膠囊上調下肢動脈硬化閉塞癥患者血清中miR-532-5p的表達與治療前比較,治療組患者給予血府逐瘀膠囊后血清中miR-532-5p表達顯著升高(P<0.05);而對照組患者治療前后miR-532-5p表達差異無統計學意義(P>0.05)。治療后,血府逐瘀膠囊治療組患者血清中miR-532-5p表達顯著高于對照組(P<0.05)。見圖1。

注:A:治療組患者治療前后血清miR-532-5p表達水平比較;B:對照組患者治療前后血清miR-532-5p表達水平比較;C:治療后兩組患者血清miR-532-5p表達水平比較;與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

3.2 血府逐瘀含藥血清可抑制ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激損傷與對照組比較,ox-LDL組HCAECs細胞活力顯著降低(P<0.05),細胞凋亡率、ROS和MDA水平顯著增加(P<0.05),SOD水平顯著降低(P<0.05);與ox-LDL組比較,血府逐瘀組細胞活力顯著升高(P<0.05),細胞凋亡率、ROS和MDA水平顯著降低(P<0.05),SOD水平顯著升高(P<0.05);與ox-LDL組比較,血府逐瘀對照組細胞活力、ROS、MDA和SOD水平以及凋亡率差異均無統計學意義(P>0.05),即對照血清對 ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激損傷無影響。見表1,圖2。

表1 血府逐瘀含藥血清對ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激損傷的影響

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡圖

3.3 血府逐瘀含藥血清對ox-LDL刺激的內皮細胞中miR-532-5p和Arp2表達的影響與對照組比較,ox-LDL組細胞中miR-532-5p表達顯著降低(P<0.05),Arp2蛋白表達顯著增加(P<0.05);與ox-LDL組比較,血府逐瘀組中miR-532-5p表達顯著增加(P<0.05),Arp2蛋白表達顯著降低(P<0.05);但是與ox-LDL組比較,血府逐瘀對照組中miR-532-5p和Arp2表達差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖3,表2。

表2 血府逐瘀含藥血清對ox-LDL刺激的內皮細胞中miR-532-5p和Arp2表達的影響

圖3 各組Arp2蛋白表達條帶圖

3.4 血府逐瘀含藥血清通過miR-532-5p調控ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激損傷與血府逐瘀組比較,血府逐瘀+miR-532-5p抑制劑組HCAECs細胞活力顯著降低(P<0.05),ROS和MDA含量以及凋亡率顯著增加(P<0.05),SOD含量顯著減少(P<0.05);但是與血府逐瘀組比較,血府逐瘀+miR-532-5p抑制劑對照組細胞活力、ROS、MDA和SOD含量以及凋亡率均無統計學意義(P>0.05)。見表3,圖4。

表3 血府逐瘀含藥血清通過miR-532-5p調控ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激損傷

圖4 流式細胞術檢測細胞凋亡圖

3.5 miR-532-5p靶向調控Arp2的表達Starbase軟件分析發現Arp2是miR-532-5p的一個潛在靶基因,兩者的結合序列見圖5A。雙熒光素酶報告基因檢測兩者的結合能力,結果見圖5B,miR-532-5p可減少轉染Arp2-Wt質粒的HCAECs熒光素酶活性(P<0.05),但不能改變轉染Arp2-Mut質粒的熒光素酶活性(P>0.05)。miR-532-5p抑制劑可增加Arp2蛋白表達,見圖5C。

注:A:miR-532-5p和Arp2的結合位點以及Arp2的突變位點;B:雙熒光素酶活性檢測;C:Western blot檢測結果。與miR-NC組比較,*P<0.05;與miR-532-5p抑制劑對照組比較,#P<0.05

4 討論

中醫認為下肢動脈硬化閉塞癥主要是由于氣血運行受阻,造成氣滯血瘀引起的,臨床上給予活血化瘀藥物可提高治療效果,改善臨床癥狀。血府逐瘀湯具有活血化瘀、通絡補氣的功效,已被發現可改善下肢動脈硬化閉塞癥患者的臨床癥狀[8,16]。在ox-LDL等氧化應激因子的刺激下,內皮細胞會產生較多的活性分子,如ROS,破壞細胞的氧化-抗氧化平衡,進而引起內皮細胞損傷誘發AS形成[17-18]。SOD是一個重要的抗氧化酶,MDA是脂質過氧化的重要標志物[19-20]。因此,ROS、MDA和SOD是內皮細胞氧化應激的重要標志物[21]。本研究中,血府逐瘀含藥血清不僅增加了ox-LDL刺激的HCAECs細胞活力、減少細胞凋亡,還降低了ROS和MDA水平、增加了SOD含量,這表明血府逐瘀含藥血清可緩解ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激損傷。

研究顯示,miR-532-5p在AS患者血清中低表達,在AS中發揮保護作用[13-14]。本研究中下肢動脈硬化閉塞癥患者服用血府逐瘀膠囊一個療程后血清中miR-532-5p表達上調,這表明血府逐瘀膠囊很可能是通過上調miR-532-5p的表達發揮作用的。Yao等[22]的研究顯示miR-532-5p可抑制ox-LDL誘導的人腦微血管內皮細胞氧化應激損傷。本研究發現ox-LDL刺激HCAECs降低了細胞中miR-532-5p表達,而血府逐瘀含藥血清可上調miR-532-5p表達。此外,miR-532-5p抑制劑可減弱血府逐瘀含藥血清對細胞活力、凋亡和ROS、MDA和SOD含量的影響,這表明血府逐瘀膠囊很可能是通過上調miR-532-5p的表達減輕內皮細胞氧化應激損傷,從而改善下肢動脈硬化閉塞癥患者癥狀的。

miRNAs通過與靶基因mRNA的3′端非翻譯區特異性結合,在轉錄水平負調控相關基因表達[23-25]。Arp2/3復合體在肌動蛋白細胞骨架重塑過程中發揮重要作用[26-27],已發表的文獻表明抑制Arp2/3復合體可減弱ox-LDL誘導的HCAECs氧化應激損傷[28]。Arp2是Arp2/3復合體中的一個重要亞基,Starbase生物信息學軟件分析顯示Arp2是miR-532-5p的一個靶基因,本研究使用雙熒光素酶報告基因分析系統驗證了miR-532-5p可與Arp2直接結合,而且miR-532-5p抑制劑可上調Arp2蛋白表達,表明Arp2是miR-532-5p的靶基因。本研究還發現,血府逐瘀含藥血清可抑制ox-LDL誘導的HCAECs中Arp2蛋白表達。這些結果提示血府逐瘀膠囊在內皮細胞中的作用與miR-532-5p的靶基因Arp2表達被抑制有關。

綜上所述,血府逐瘀膠囊可通過上調miR-532-5p抑制其靶基因Arp2的表達,進而抑制ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激損傷,從而緩解下肢動脈硬化閉塞癥患者的癥狀。本研究進一步闡明了血府逐瘀膠囊治療下肢動脈硬化閉塞癥的分子機制,為其臨床應用提供了一定的實驗依據。