轉基因在菊花葉肉原生質體瞬時表達及亞細胞定位分析

丁林云　萬可　楊丹　王同　王春梅　郭書巧　楊霞

摘要： 為探究用于亞細胞定位研究的菊花葉肉原生質體分離的最適條件，本研究以菊花無菌苗葉片為受體材料，分析不同葉齡葉片和酶解時間對菊花原生質體細胞產量的影響，并利用外源質粒的導入驗證了聚乙二醇（PEG）介導的菊花原生質體瞬時轉化體系。結果表明，以組織培養14 d的菊花無菌苗葉片為外植體材料，在含1.5%纖維素酶、0.4%離析酶和0.8 mol/L甘露醇的酶解液中振蕩酶解6 h，能獲得高產的原生質體細胞。采用PEG介導的瞬時轉化含綠色熒光蛋白（GFP）的表達載體，在菊花原生質體細胞中觀察到強烈的綠色熒光信號。結果顯示，稗草乙烯轉錄因子基因（EcERF）在菊花原生質體中與本氏煙草葉片中的瞬時表達一致， EcERF基因定位于細胞核中。

關鍵詞： 菊花；原生質體；瞬時表達；亞細胞定位

中圖分類號： S682.1⁺¹文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0518-07

Analysis of transient expression of chrysanthemum mesophyll protoplasts and subcellular localization

DING Lin-yun^1，2， WAN Ke³， YANG Dan^1，2， WANG Tong^1，2， WANG Chun-mei^1，2， GUO Shu-qiao^1，2， YANG Xia^1，2

（1.Central Laboratory of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Institute of Crop Germplasm and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;3.College of Agriculture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： To explore the optimal condition for the separation of mesophyll protoplasts of chrysanthemum for subcellular localization study， leaves of aseptic chrysanthemum seedlings were used as acceptor material in this study to analyze the effects of leaves with different culture times and different enzymatic hydrolysis time on the yield of chrysanthemum protoplast cells， and polyethylene glycol （PEG）-mediated transient transformation system of chrysanthemum protoplasts was verified by leading in exogenous plasmids. The results showed that， protoplasmic cells with high yield could be obtained by shaking enzymatic hydrolysis for six hours in enzymatic hydrolysis solution containing 1.5% cellulase， 0.4% macerozyme and 0.8 mol/L mannitol， using leaves of aseptic chrysanthemum seedlings cultured for 14 days as explants material. A strong green fluorescent signal was observed in chrysanthemum protoplast cells by using PEG mediated expression vector for transient transformation containing green fluorescent protein （GFP）. The results indicated that ethylene transcription factor gene in Echinochloa crusgalli （EcERF） were transiently expressed in chrysanthemum protoplasts and tobacco （Nicotiana benthamiana） leaves， which were both located in the nucleus.

Key words： chrysanthemum;protoplast;transient expression;subcellular localization

菊花（Dendranthema morifolium Ramat.）是菊科菊屬多年生宿根草本植物，其種質資源豐富，起源于中國并廣泛栽培于世界各地，具有較高的觀賞、食用、茶飲和藥用價值，在生產和園林應用中具有重要作用^[1-2]。隨著社會發展及人們生活水平的提高，菊花產業發展迅速，不斷增長的菊花需求促使科學家們選育出新型性狀、耐脅迫、品質高的菊花品種，然而，菊花的高度雜合性和多倍性給菊花功能基因的鑒定工作增加了難度，給菊花育種工作帶來了很大的挑戰^[3-4]。據研究，原生質體細胞作為優質轉化外植體運用于瞬時表達分析，可為關鍵基因的功能研究、轉基因研究提供重要的材料基礎，可為菊花育種研究提供重要的技術手段。

原生質體是植物細胞經酶解或機械去除細胞壁后分離純化的裸露細胞，具有細胞全能性，能夠高效表達外源DNA^[5]。植物原生質體作為功能基因研究的轉化受體材料，能夠讓植物細胞快速增殖和植物再生，廣泛應用于植物分子育種、亞細胞定位、基因啟動子活性、信號轉導以及蛋白質互作等方面^[6-9]。據報道，利用原生質體的高效瞬時基因表達系統在許多植物（包括煙草^[10]、擬南芥和玉米^[11]、水稻^[12]、棉花^[13]、多年生黑麥草^[14]、短梗草^[15]、茶樹^[16]等）中已成功建立原生質體瞬時轉化體系，在植物的非生物脅迫和生物脅迫等研究中得到了應用^[17-18]。菊花中原生質體分離和再生體系近幾年才有報道^[19]，將外源基因轉化的菊花原生質體細胞進行瞬時表達，并進行目標基因功能分析的報道較少^[20]，且不同菊花品種之間可能存在差異。參考擬南芥等模式作物原生質體瞬時表達系統，本研究以金絲皇菊菊花品種為轉化受體，研究其用于瞬時轉化研究的原生質體葉肉分離的最適條件，將帶有綠色熒光蛋白（GFP） 報告基因的質粒轉化菊花原生質體細胞，以期進行外源基因的亞細胞定位應用研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料

菊花品種為金絲皇菊，幼苗來源于江蘇省淮安茹園生態農業種植基地。將生長至葉片數為（15±1）張的菊花苗移栽到溫室（25 ℃，16 h光照/8 h黑暗）進行盆栽培養，選取完全展開、綠色無病害的菊花植株，取其頂芽培養的無菌苗作為外植體。

煙草品種為本氏煙（Nicotiana benthamiana），種子由本研究室保存。將煙草種子撒播于無菌營養土中，盆栽（26 ℃，16 h光照/8 h黑暗）培養30 d左右，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菊花無菌苗的培養 選取完全展開的健康菊花葉片頂芽，流水下沖洗2 h；無菌環境下，用體積分數70%乙醇表面滅菌30 s，用無菌水沖洗；然后用 0.1% HgCl₂浸泡6 min，再用無菌水沖洗5～6次。切割2～3 cm 左右的葉片頂芽并去除葉片，接種于含1.2 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA） +0.3 mg/L萘乙酸（NAA）的MS培養基中，進行無菌苗成苗培養。待培養15～30 d后，頂芽伸長并葉片舒展，株高1～2 cm，將伸長芽接種至含0.5 mg/L吲哚丁酸（IBA）的1/2 MS培養基中生根培養，誘導大量不定根生成，獲得菊花無菌苗。

1.2.2 菊花外植體的制備 獲得菊花生根無菌苗后，溫室繼代培養14 d。挑選健康、發育完全的菊花無菌苗植株，選取長勢良好、大小一致、飽滿圓潤的倒3葉和倒4葉葉片。基于高產原生質體細胞的獲得，進行外植體最適生長周期的篩選，試驗設置菊花無菌苗不同繼代培養時間：6 d、10 d、14 d和18 d，每個處理重復3次。

1.2.3 菊花原生質體細胞的分離 將1.0～1.5 g無菌苗葉片置于覆蓋濾紙的玻璃培養皿上，用刀片將葉鞘切成1～2 mm的細絲狀，并迅速浸入配制好的20 ml酶解液[含1.5%纖維素酶R-10、0.4%離析酶R-10、 0.8 mol/L甘露醇、0.2 mol/L 嗎啉乙磺酸鈉（MES）（pH 5.7）、2.0 mol/L NaCl、1.0 mol/L CaCl₂、2.0 mol/L KCl、2.0 mol/L MgCl₂]中，使其充分散開，26 ℃避光，置于搖床輕搖（40 r/min）酶解，至酶解混合液呈現淡綠色，肉眼觀察到沉淀細胞。考慮在不同酶解時間條件下，獲得的原生質體細胞質量有差異，試驗設置了不同梯度的酶解時間：2 h、4 h、6 h和8 h。每個處理重復3次。

1.2.4 菊花原生質體細胞的純化與產量檢測 預先用W5溶液（含2.0 mol/L NaCl， 1.0 mol/L CaCl₂， 2.0 mol/L KCl， 0.2 mol/L MES）浸潤無菌細胞過濾器（40 μm），過濾酶解混合液至培養皿中，并沿著管壁輕輕加入到50 ml離心管，再吸取20 ml W5溶液潤洗酶解液的燒杯、細胞篩及培養皿，收集其中殘余的原生質體細胞，與濾液加入到同一個50 ml離心管輕旋混勻。使用吊籃低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司產品），1檔升/降速，4 ℃、60 g離心4 min，棄去上清液，加入20 ml W5溶液重懸細胞，1檔升/降速，4 ℃、60 g離心4 min，棄去上清液。沉淀加入適量的W5重懸細胞。

取1 ml純凈的原生質體懸浮液進行鏡檢，取8 μl滴于載玻片上，用18 mm×18 mm的蓋玻片加蓋，利用熒光顯微鏡進行圖片采集，在10倍物鏡視野（640 mm×480 mm）下觀察總原生質體數，生物學3次重復，試驗設置3次重復，取平均值。按植物原生質體簡易計數法^[21]統計原生質體總密度，原生質體總密度（個，1 ml）=［（1 000÷8）×（18×18÷3.14）］×平均值。

1.2.5 載體制備 將目的基因稗草乙烯轉錄因子（EcERF）插入到植物表達載體pBinGFP4中^[22]，構建EcERF：：GFP融合表達載體，以pBinGFP4空載體為對照，進行菊花原生質體瞬時轉化；并將稗草乙烯轉錄因子基因插入到含黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein， YFP）的植物表達載體pCAMBIA1300-YFP中，構建EcERF：：YFP融合表達載體，進行煙草的瞬時轉化。

1.2.6 目標基因在菊花原生質體中的瞬時轉化 加入適量的MMG（0.8 mol/L 甘露醇， 2.0 mol/L MgCl₂， 0.2 mol/L MES）溶液于原生質體細胞沉淀中，混勻后利用吊籃低速離心機，1檔升/降速，4 ℃、60 g轉速離心4 min，棄去上清液。分別將重組質粒EcERF：：GFP和空載體pBinGFP4質粒各10 μg（1 μg/μl， 10 μl）與原生質體細胞按照體積比1∶30混勻，加入與質粒DNA及原生質體細胞混合液等體積的40%聚乙二醇（PEG，4000）溶液。然后，立即輕柔混勻，室溫靜置15 min。再加入2倍體積的W5溶液，輕彈混勻，再次離心。加入2 ml W5溶液，輕彈或顛倒混勻，26 ℃避光，靜置過夜培養8～12 h。

取出過夜培養的原生質體轉化體培養液，1檔升/降速，60 g轉速離心4 min，收集沉淀。去除上清液，加入適量的W5溶液重懸原生質體。利用激光共聚焦顯微鏡（珀金埃爾默儀器有限公司產品）進行觀察，顯示綠色熒光信號的原生質體為已成功轉化的原生質體，觀察GFP在菊花原生質體細胞中是否正常表達，計算其轉化率。原生質體轉化率=綠色熒光視野中原生質體個數/明場中原生質體個數×100%。

1.2.7 目標基因在煙草中的亞細胞定位 將EcERF：：YFP載體導入菌株GV3101中，挑取單克隆置于含有卡那霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的液體LB培養基中，28 ℃振蕩培養24 h，4 000 r/min，離心20 min，棄去上清液。用緩沖液[10 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L MES（pH 5.7），200 μmol/L 乙酰丁香酮（AS）]重懸浮2次， 將OD₆₀₀調至0.5左右。黑暗室溫放置3～4 h，用1 ml的針頭注射器將菌液注入煙草葉片的反面，注射后48～72 h用激光共聚焦顯微鏡觀察，使用細胞核染料4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）作為細胞核定位的標記。

2 結果與分析

2.1 菊花原生質體細胞體系的制備

選取菊花組培苗幼嫩葉片作為外植體（圖1a）并切成均勻的細絲，再迅速置于酶解混合液中（圖1b）。充分酶解受體組織，破除細胞壁并釋放原生質體細胞，收集菊花的原生質體沉淀后進行純化（圖1c），鏡檢獲得大量的菊花葉片原生質體細胞，并且產生少量碎片（圖1d）。

2.2 不同培養時間對菊花原生質體細胞分離的影響

研究結果表明，在相同的酶解時間下，不同培養時間的菊花組培苗獲得的原生質體細胞得率存在顯著差異。參考宋愛華等^[20]的方法選擇酶解時間4 h、組培時間6 d的菊花無菌苗的葉片，產生了極少量的原生質體（圖2a）；選用培養10 d的組培苗的葉片制備原生質體細胞，獲得的原生質體大小均一，且產量顯著增加，細胞碎片減少（圖2b）；當培養時間達到14 d時，獲得原生質體的數量達到最高值（圖2c）。但是，隨著培養時間延長，培養18 d的菊花無菌苗獲得的原生質體產量卻開始下降（圖2d）。因此，選取培養14 d 的菊花組培苗嫩葉為最佳外植體材料，能獲得純凈原生質體細胞，且數量可達1 ml 4.9×10⁵個（圖3）。

2.3 不同酶解時間對原生質體細胞分離的影響

不同的酶解時間對獲得的原生質體的產量有較大影響。在滲透壓、葉齡一致的條件下，不同的酶解時間，原生質體的產量有明顯差異。在酶解2 h后，菊花葉片開始變軟，并有少量的原生質體細胞產生（圖4a）；酶解4 h后，游離出的原生質體細胞數量逐漸增多（圖4b）；酶解6 h后，酶解液的酶解效率最高（圖4c），原生質體產量達到1 ml 9.4×10⁵個。但是，酶解8 h后，因已分離出的原生質體會破開，細胞碎片增加，原生質體的得率減少（圖4d）。結果顯示，菊花葉片最適酶解時間為6 h（圖5）。

2.4 菊花原生質體的遺傳轉化

激光共聚焦顯微鏡的觀察結果顯示，在菊花的原生質體細胞的細胞核、質膜等部位均可檢測到綠色熒光（圖6），與同一視野其明場原生質體細胞相比，計算得出成功轉化綠色熒光原生質體細胞的陽性轉化率達91.3%。結果表明，本研究已將帶有GFP熒光蛋白的空載體質粒DNA成功轉入菊花原生質體中，并進行了有效的瞬時表達。

2.5 菊花原生質體瞬時轉化體系的驗證

將EcERF：：YFP載體轉化煙草，采用DAPI染料作為細胞核定位標記，發現與EcERF融合的YFP的熒光信號與DAPI共定位，表明EcERF基因定位于細胞核中（圖7）。將EcERF基因融合GFP蛋白，在菊花原生質體細胞中進行瞬時轉化，結果表明，EcERF基因亦定位于細胞核中（圖8），與該基因在煙草中的定位結果一致。

3 討論

3.1 高質量菊花原生質體的制備

在進行植物原生質體的制備過程中，選擇合適的外植體材料、不同的酶解時間、合適的滲透壓、不同酶液質量濃度或幾個關鍵因素組合，對于高質量原生質體細胞的獲得至關重要。本研究利用酶解法分離純化出菊花葉肉的原生質體細胞，對影響制備菊花原生質體的上述部分關鍵因素進行探索分析。不同生理狀態和生長周期的植物外植體，對獲得高產量原生質體有著極其重要的影響。本試驗選用組織培養14 d的菊花無菌苗，并挑選生長狀態良好的菊花無菌苗倒3～4葉葉片提取原生質體，獲得了1 ml 4.9×10⁵個以上的原生質體。而酶解時間的長短是獲得高產原生質體的另一個重要條件，植物原生質體細胞的產量會隨著酶解時間的延長而逐漸下降。在選擇最適培養周期（14 d）的菊花無菌苗的條件下，進行最佳酶解時間的摸索，發現酶解6 h時，獲得的原生質體的數量與質量均最佳，產量達1 ml 9.4×10⁵個；當酶解時間達到 8 h時，原生質體的數量呈下降趨勢。在其他試驗條件一致的前提下，酶解時間越長，細胞質和細胞膜越易受到傷害，產生破碎的細胞也越多，對細胞產生的毒害作用亦越大。因此，酶解時間是否合適是能否獲得優質的原生質體的重要限制因素之一。

3.2 目標基因在菊花原生質體細胞中的有效表達

目前，關于菊花的轉基因功能研究已有很多報道，如轉錄因子基因DgWRKY5^[23]、CmERF053^[24]、ClCBF1^[25]等，在菊花育種上具有很高的產業應用前景。本研究運用已建立的菊花原生質體制備及瞬時轉化體系，對ERF轉錄因子家族基因EcERF進行亞細胞定位，EcERF蛋白清晰定位在細胞核上，表明該體系可用于基因的功能研究。

在進行原生質體細胞轉化過程中，原生質體細胞質量的高低直接影響到轉化效率。首先，內毒素對細胞具有毒性，在極大程度上影響細胞的轉化效率。為確保目的基因成功轉化原生質體細胞，本試驗利用無內毒素質粒提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]大量提取重組質粒和空載體質粒，成功轉化原生質體；其次，如果載體質粒DNA濃度過高或過低，均會影響蛋白質的有效瞬時表達。本研究通過紫外-可見光全光譜分光光度計測定的質粒DNA質量濃度在1 μg/μl以上，OD₂₆0/OD₂₈0為1.8～2.0時，能夠有效地將目的基因轉入原生質體細胞。

鑒于菊花的生理特性，結合菊花外植體的材料選擇，對菊花原生質體制備的其他因素進行了優化。為提高菊花葉肉細胞的酶解效率，對酶解液進行預處理（55 ℃水浴10～15 min），能夠提高酶的活性，提高破碎植物細胞壁的效率，大大縮短酶解時間，降低細胞毒害，從而減少因細胞破碎產生的細胞碎片，降低亞細胞的數量，有助于獲得產量高且大小一致的原生質體細胞。在酶解過程中選擇避光和輕柔振蕩，能夠有效提高酶解效率，大大縮短酶解時間，為進一步高質量的基因轉化提供基礎。此外，由于原生質體是裸露的無細胞壁的細胞，極易破裂，離心力大小可能會影響原生質體的得率。因此，本研究選擇60 g、1檔升/降速，適宜的離心速度可以減少原生質體受外力破壞的程度，有利于獲得高質量的原生質體細胞。

4 結論

綜上所述，以組織培養14 d的菊花無菌苗葉片為外植體，酶解液組合為1.5%纖維素酶、0.4%離析酶和0.8 mol/L甘露醇，26 ℃避光振蕩酶解6 h，獲得高質量的菊花原生質體細胞，并成功進行了EcERF基因的瞬時表達，對EcERF基因在煙草中的亞細胞定位的結果進行了佐證，證明EcERF蛋白清晰定位于細胞核中。

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（責任編輯：陳海霞）