褪黑素對妊娠期糖尿病大鼠胰腺自噬的影響及其機制

鄭晴晴 李超 李巖 喬炳龍 馬春玲

(1 青島大學醫學部,山東 青島 266071; 2 棗莊市市中區婦幼保健院婦產科;3 青島大學附屬醫院產科; 4 青島大學附屬醫院放射科)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)在世界范圍的發病率約為16%,一旦發病會明顯增加不良妊娠結局的發生率[1-2]。炎癥反應、滋養細胞功能障礙等是影響GDM進程的因素[3-4]。近年來研究表明機體自噬水平變化對GDM的進展也起到一定作用[5]。目前胰島素注射為GDM的主要治療方式,但其存在使用不便、注射依從性差等缺點[6]。而褪黑素在部分實驗中被證實可控制血糖濃度及調節機體的自噬水平[7-8]。但目前關于褪黑素對GDM中胰腺組織自噬影響的研究較少,本研究首次探討了褪黑素對GDM大鼠胰腺自噬的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

褪黑素購自美國MCE生物技術有限公司,HE染色液購自北京索萊寶科技有限公司,葡萄糖及糖化血紅蛋白檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,胰島素試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物有限公司,Tunel細胞凋亡染色液購自上海碧云天生物技術有限公司,兔單抗甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、Beclin1、磷脂磷肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)均購買于武漢愛博泰克生物技術有限公司,兔多抗磷酸化PI3K(p-PI3K)購自英國Abcam生物技術有限公司,兔單抗磷酸化AKT(p-AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及磷酸化mTOR(p-mTOR)購自美國CST生物技術有限公司。

1.2 動物造模和分組

SPF級的Wistar大鼠購自湖北實驗動物研究中心[動物許可證號SCXK(鄂)2020-0018],體質量250～270 g。將大鼠在溫度(23.0±2.0)℃、濕度(52.5±12.5)%的條件下適應性飼養7 d以后造模[9-10]。造模前大鼠禁食不禁水12 h,然后測定大鼠空腹血糖,選取血糖值≤6.1 mmol/L的雌性大鼠共28只納入實驗,并隨機分為正常妊娠組(A組)、GDM組(B組)、GDM褪黑素低劑量組(C組)以及GDM褪黑素高劑量組(D組),每組7只。將各組雌性大鼠與雄性大鼠按2∶1比例進行合籠,次日取雌性大鼠陰道分泌物制作涂片,通過顯微鏡檢測有無精子,涂片有精子的雌性大鼠記做妊娠第0天,無精子的雌性大鼠重復上述合籠步驟直至受孕。妊娠第0天,A組大鼠腹腔注射枸櫞酸鹽緩沖液,其余組大鼠腹腔注射45 mg/kg鏈脲佐菌素溶液誘導GDM模型。妊娠第3天,A組大鼠正常飼養,B～D組大鼠麻醉后用醫用棉片消毒鼠尾,剪去尾尖,棄掉第一滴血后檢測血糖濃度,血糖濃度≥16.7 mmol/L的大鼠即造模成功。造模結束后,A、B組大鼠每天灌胃10 mL/kg生理鹽水,C、D組大鼠每天分別灌胃5、10 mg/kg褪黑素[11],各組每天均灌胃1次,連續灌胃14 d后以戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經腹腔注射麻醉后處死各組大鼠,剪開大鼠胸腔取左心室血5 mL于4 ℃下保存。隨后剪開各組大鼠腹腔,取各組大鼠胰腺樣本,將每只大鼠的胰腺樣本分為3份,1份于40 g/L多聚甲醛中室溫保存用于病理染色,1份于戊二醛中于4 ℃下保存用于電鏡檢查,1份于-80 ℃凍存用于后續免疫印跡檢測。

1.3 各組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平檢測

取各組大鼠的血液樣本,以3 000 r/min離心10 min,吸取上層血清樣本。根據相應商品試劑盒說明書對血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白含量進行測定。

1.4 HE染色觀察各組大鼠胰腺組織病理變化

取各組大鼠的胰腺組織,在40 g/L多聚甲醛中浸泡固定48 h,再通過乙醇梯度脫水、石蠟包埋及切片后通過蘇木素染色,1%鹽酸乙醇分化,伊紅復染封片后顯微鏡下采集圖片。

1.5 Tunel染色觀察各組大鼠胰腺細胞凋亡情況

取各組大鼠胰腺組織,在40 g/L多聚甲醛中浸泡固定48 h后,通過乙醇梯度脫水、石蠟包埋及切片后加蛋白酶K室溫孵育20 min,Tunel細胞凋亡染色液暗室孵育60 min,DAPI染色液染核,熒光封片劑封片后顯微鏡下拍照觀察胰腺細胞凋亡情況。

1.6 透射電鏡觀察各組大鼠胰腺組織細胞自噬

取各組大鼠胰腺組織,于電鏡固定液固定,脫水后樹脂滲透包埋,隨后制備切片進行醋酸鈾和檸檬酸鉛各染色5 min,透射電鏡下觀察拍照。

1.7 免疫印跡法檢測各組大鼠胰腺組織自噬相關蛋白的表達情況

將少量剪碎的各組大鼠胰腺組織勻漿、裂解后,提取總蛋白檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品在SDS-PAGE上電泳,PVDF轉膜,封閉液室溫中孵育2 h,添加LC3、Beclin1、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR及GAPDH一抗于4 ℃搖床孵育12 h,添加二抗室溫孵育2 h,ECL化學發光顯影,通過Image J軟件分析各個蛋白條帶的灰度值,并計算目的蛋白相對表達量。每組實驗重復3次,結果取均值。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平比較

單因素方差分析顯示,各組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平比較均有顯著差異(F=52.26～66.73,P<0.05)。與A組相比,B組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平均顯著上升(t=-14.45～7.23,P<0.05);與B組相比,C、D組大鼠血清中葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平顯著下降(t=-5.32～10.02,P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平比較

2.2 各組大鼠胰腺組織病理變化比較

HE染色結果顯示,A組大鼠胰腺組織中胰島形態規則,細胞排列有序;B組大鼠胰島組織形態結構不規則,細胞間排列紊亂,胰島邊界不清晰,部分胰島細胞漿出現空泡變性;C組大鼠胰島形態趨于規則,細胞排列較為整齊,胰島與外分泌腺界限較為清晰;D組大鼠胰島形態規則,細胞排列整齊,胰島與外分泌腺界限清晰。見圖1。

2.3 各組大鼠胰腺組織細胞凋亡情況比較

Tunel染色結果顯示,與A組相比,B組大鼠胰腺組織細胞凋亡增加;與B組相比,C、D組大鼠胰腺組織細胞凋亡減少,且D組的細胞凋亡減少更加明顯。

注:黑色箭頭所指為胰島

2.4 各組大鼠胰腺組織自噬情況比較

透射電鏡觀察結果顯示,A組大鼠胰腺組織中可見明顯且清晰的線粒體及內質網等細胞器結構,無明顯的自噬體出現;B組大鼠胰腺組織中可見細胞核出現固化、碎裂,核膜皺縮不清,出現明顯自噬體;C、D組可見細胞質中線粒體、內質網、細胞核等結構基本正常,并有少量自噬體。見圖2。

2.5 各組大鼠胰腺組織中自噬相關蛋白的相對表達水平比較

免疫印跡法檢測結果顯示,各組大鼠胰腺組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平及Beclin1相對表達量比較均有顯著差異(F=27.68～67.72,P<0.05),與A組相比,B組大鼠胰腺組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平和Beclin1相對表達量顯著上升(t=-8.13～-6.83,P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平則均顯著下降(t=8.83～14.05,P<0.05);與B組相比,C、D組大鼠胰腺組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平和Beclin1相對表達量均顯著下降(t=3.36～6.95,P<0.05),而p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的水平則均顯著上升(t=-9.64～-3.51,P<0.05)。見表2。

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠胰腺組織自噬情況(7 800倍)

表2 各組大鼠胰腺組織自噬相關蛋白表達水平比較

3 討 論

研究表明,全球孕婦中約有6～9%患有糖尿病,而其中約90%為GDM患者[12]。目前胰島素治療GDM有較好效果,但胰島素存在使用不便、成本高昂等缺點[13],因此探尋GDM治療的新型藥物是科研工作者關注的熱點。褪黑素可調節多種生命活動,如調節衰老、焦慮和免疫反應等[14-15]。有研究表明褪黑素對GDM具有一定治療作用。LIU等[16]研究表明,褪黑素能調節ERK通路誘導神經干細胞增殖,進而能夠防止GDM小鼠子代神經畸形。DE MELO等[17]研究表明,褪黑素能減少GDM大鼠胎兒身長及體質量異常。孫平等[11]研究也表明,褪黑素能下調GDM大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平。本研究中,與B組相比,D組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平下降,胰腺組織病理損傷及凋亡減輕,與既往研究結果類似。血清糖化血紅蛋白水平能夠反映過去一段時間機體的血糖水平,胰島素能降低機體血糖含量,GDM大鼠血清葡萄糖的降低能一定程度控制疾病的進展。故提示褪黑素能減輕GDM大鼠胰腺的損傷。

近年來,胎盤自噬、滋養細胞自噬等在GDM疾病的進展中得到越來越多的關注。目前研究最廣泛的自噬類型是巨自噬,其為降解受損細胞器和蛋白質的主要途徑。基于不同的環境(如缺氧、缺血等),滋養細胞自噬的發生既可一定程度增加細胞的生存能力,也能夠誘導細胞死亡[18]。自噬的調控機制錯綜復雜,PI3K/AKT/mTOR通路是其主要調控通路。PI3K/AKT/mTOR信號通路中PI3K能夠激活AKT磷酸化,繼而調節mTOR磷酸化,抑制自噬進程[19]。近年來文獻表明,胰島與GDM的進展有著重要的聯系,ZHAO等[20]研究表明miRNA-221可通過靶向PAK1調節胰島β細胞的增殖,降低GDM誘導的胰島功能障礙;ZHANG等[21]研究表明黃芪甲苷能抑制GDM小鼠胰腺中NLRP3炎性小體形成;邢寶恒等[22]研究證明白藜蘆醇可以增加GDM大鼠胰島素的分泌,改善胰腺組織病變。但GDM與胰腺組織自噬關系的研究報道較少。基于本研究中褪黑素能減輕GDM大鼠胰腺損傷的結果,我們進一步檢測了GDM大鼠胰島組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平和Beclin1相對表達量及自噬經典通路PI3K/AKT/mTOR的變化。本研究結果表明,與B組大鼠相比較,D組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平及Beclin1相對表達量均有顯著下降,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR水平升高,說明褪黑素能激活GDM大鼠胰腺組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路,從而抑制自噬水平。而自噬水平的降低能夠一定程度緩解高水平自噬誘導的細胞死亡,從而減輕組織病理損傷[23-25]。因此上述研究結果表明褪黑素可能通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制GDM大鼠胰腺組織中過高水平的自噬,從而減輕胰腺組織的病理損傷。

綜上所述,褪黑素能夠改善GDM大鼠血糖濃度以及胰腺組織的病理損傷,其具體機制可能和調控PI3K/AKT通路抑制胰腺組織的異常高水平自噬有關。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫學部倫理委員會的審核批準(文件號QYFYECKY-2022-002-11)。所有實驗過程均遵照《動物實驗管理守則》的條例進行。

作者聲明：鄭晴晴、李超、李巖、喬炳龍和馬春玲參與了研究設計;鄭晴晴、李超、李巖參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。