侖伐替尼對(duì)肝細(xì)胞癌組織中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞自噬和遷移的影響

趙梓吟 何明陽(yáng) 韓冰 關(guān)鴿 蔡金貞 張斌

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266100 1 器官移植中心; 2 肝膽胰外科)

全球范圍內(nèi)肝癌的發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì),其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見(jiàn)的肝癌類(lèi)型,其發(fā)病率約占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的75%,確診以后5年的生存率僅約為18%[1-2]。盡管手術(shù)切除、射頻消融和經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞等治療方案改善了無(wú)轉(zhuǎn)移HCC患者的預(yù)后,但多數(shù)HCC患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期,對(duì)于無(wú)法手術(shù)的中晚期HCC患者,往往只能采取保守方案治療[3]。目前治療HCC的一線(xiàn)藥物包括阿替利珠單抗+貝伐珠單抗、多納非尼、侖伐替尼、索拉菲尼等,其中侖伐替尼作為多靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑,適用于不可切除的肝功能為Child-Pugh A級(jí)的晚期HCC患者[4-6]。

近年來(lái),對(duì)于腫瘤發(fā)展機(jī)制和治療方法的研究探索重心逐漸從腫瘤本身轉(zhuǎn)向其所處的腫瘤微環(huán)境(TME)[7-8],TME中基質(zhì)細(xì)胞具有遺傳穩(wěn)定性,可有效降低腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[9-11]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)是激活的成纖維細(xì)胞,作為T(mén)ME中最主要的基質(zhì)細(xì)胞成分以及細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵來(lái)源[12],CAFs在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中有關(guān)鍵作用,目前已經(jīng)成為潛在腫瘤治療靶點(diǎn)[13-15]。研究發(fā)現(xiàn),侖伐替尼可通過(guò)作用于腫瘤的多個(gè)靶點(diǎn)達(dá)到抑癌的作用,比如可靶向阻斷腫瘤的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)途徑抑制腫瘤血管生成,可通過(guò)使腫瘤細(xì)胞饑餓和缺氧抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)致死亡,但侖伐替尼能否影響CAFs的生物學(xué)行為尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬探究侖伐替尼對(duì)CAFs生物學(xué)功能的影響及其機(jī)制,旨在為HCC患者的個(gè)性化治療提供理論依據(jù),同時(shí)為靶向TME的治療方式提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集于青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科確診為HCC的3例患者的腫瘤組織以及癌旁正常組織標(biāo)本用于原代CAFs分離培養(yǎng)。膠原酶、青鏈霉素購(gòu)買(mǎi)于美國(guó) Sigma公司;α-SMA抗體購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)cst公司,侖伐替尼購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)MCE公司;NEBNext UltraTM RNA文庫(kù)準(zhǔn)備試劑盒購(gòu)于美國(guó)Illumina公司。JEM-1200EX透射電鏡購(gòu)于日本JEOL公司,超薄切片機(jī)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Ultracute公司,光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司。

1.2 CAFs的分離、純化、培養(yǎng)及分組

取3例患者的癌組織以及癌旁正常組織,用含10 g/L青鏈霉素的PBS溶液4 ℃下清洗2次,剪碎組織后,置于10 mL含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清以及體積分?jǐn)?shù)0.001的Ⅳ型膠原酶溶液中,37 ℃下恒溫?fù)u床中消化30 min。將消化液用200目濾網(wǎng)過(guò)濾,670 r/min離心5 min,棄上清液后再漂洗2次,使用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后,置于完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清及10 g/L青鏈霉素的DMEM高糖型培養(yǎng)基)中繼續(xù)培養(yǎng),3 d后更換新的完全培養(yǎng)基。在含有100 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的完全培養(yǎng)基中采用自然傳代法對(duì)CAFs進(jìn)行純化,獲得原代CAFs細(xì)胞。再將原代CAFs細(xì)胞重新培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待CAFs傳代3次且細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí),分別于培養(yǎng)基中加入46 nmol/L的侖伐替尼和等體積的DMSO,分為侖伐替尼組和DMSO組,繼續(xù)培養(yǎng)72 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CAFs的免疫熒光檢測(cè)

將培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組CAFs接種于鋪有細(xì)胞爬片的24孔板中,在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,PBS清洗3次,40 g/L多聚甲醛固定30 min。再以PBS配置的體積分?jǐn)?shù)0.003的曲拉通溶液常溫滲透15 min,PBS配置的體積分?jǐn)?shù)0.05山羊血清常溫封閉1 h,α-SMA一抗孵育過(guò)夜后,加入FITC二抗室溫孵育2 h,DAPI復(fù)染7 min,PBS清洗后滴加甘油封片。使用激光共聚焦顯微鏡拍照并觀(guān)察兩組細(xì)胞中的α-SMA熒光強(qiáng)度。

1.4 CAFs的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序及富集分析

委托上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司對(duì)培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組的CAFs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)樣本。根據(jù)基因表達(dá)分析結(jié)果篩選兩組間差異表達(dá)的基因(P<0.05),并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析(http://geneontology.org)以及KEGG信號(hào)通路富集分析(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。

1.5 侖伐替尼在CAFs上的藥物靶點(diǎn)組學(xué)測(cè)序及富集分析

委托上海中科新生命生物科技有限公司對(duì)培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組的CAFs進(jìn)行藥物靶點(diǎn)組學(xué)測(cè)序。通過(guò)質(zhì)譜分析對(duì)肽段酶切產(chǎn)物進(jìn)行序列鑒定和數(shù)據(jù)非依賴(lài)性采集(DIA)蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析,確定侖伐替尼在CAFs上結(jié)合的靶蛋白及序列,并對(duì)靶蛋白進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。

1.6 CAFs的透射電鏡掃描

將培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組CAFs接種于鋪有細(xì)胞爬片的24孔板中,在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后4 ℃下以體積分?jǐn)?shù)0.025的戊二醛固定4 h。用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次,每次10 min,再用4 ℃體積分?jǐn)?shù)為0.01的鋨酸固定細(xì)胞2 h,用PBS緩沖液沖洗3次,每次10 min。用體積分?jǐn)?shù)0.3、0.5、0.7、0.8、1.0的梯度乙醇對(duì)兩組細(xì)胞依次脫水,每次10 min。之后Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋樣本,依次以37、45、65 ℃溫箱固化,每級(jí)溫度下24 h。半薄切片定位后用超薄切片機(jī)切片,醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色,最后使用透射電鏡觀(guān)察。

1.7 CAFs的Transwell實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)72 h后的DMSO組和侖伐替尼組的CAFs更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,接種于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基的Transwell上室(8 μm/孔)中,在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,室溫下對(duì)遷移至下室的細(xì)胞用0.5%結(jié)晶紫染色20 min。使用光學(xué)顯微鏡對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行拍照,對(duì)遷移CAFs進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 CAFs劃痕實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組的細(xì)胞平鋪在6孔板中,待CAFs融合度達(dá)90%以上時(shí),使用200 μL濾芯吸頭尖端在6孔板上劃痕。劃痕后將原培養(yǎng)基立即更換為含體積分?jǐn)?shù)0.02胎牛血清的低血清培養(yǎng)基,用電子顯微鏡拍攝劃痕區(qū)域,分別于劃痕后0、24 h時(shí)采集圖像,并計(jì)算傷口愈合百分比,計(jì)算公式為:傷口愈合百分比=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CAFs轉(zhuǎn)錄組學(xué)的測(cè)序結(jié)果及其GO功能及KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

免疫熒光染色結(jié)果顯示,CAFs標(biāo)志物α-SMA染色陽(yáng)性率>90%(圖1),圖中紅色為α-SMA染色的CAFs,藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核,提示分離培養(yǎng)培養(yǎng)成功,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果示,與DMSO組進(jìn)行比較,侖伐替尼組CAFs共有2 054個(gè)基因顯著上調(diào),2 109個(gè)基因顯著下調(diào)(P<0.05);GO功能富集分析顯示,差異基因與細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)、成纖維細(xì)胞遷移、自噬體、溶酶體等功能密切相關(guān);KEGG信號(hào)通路富集分析顯示,差異基因參與的通路主要有溶酶體相關(guān)通路、PI3K-AKT通路、動(dòng)物自噬相關(guān)通路、癌癥相關(guān)通路、肝細(xì)胞癌相關(guān)通路等。

2.2 CAFs藥物靶點(diǎn)組學(xué)的測(cè)序結(jié)果及其富集分析

對(duì)CAFs藥物靶點(diǎn)組學(xué)測(cè)序結(jié)果中篩選出的P<0.05的差異肽段進(jìn)行GO功能及KEGG信號(hào)通路富集分析,顯示顯著富集的差異肽段與細(xì)胞遷移、細(xì)胞動(dòng)力、細(xì)胞骨架、溶酶體等相關(guān),差異基因參與的通路主要有細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、肝細(xì)胞癌、細(xì)胞凋亡、PI3K-AKT通路、癌癥相關(guān)通路等。

2.3 侖伐替尼對(duì)CAFs自噬及遷移的影響

透射電鏡掃描結(jié)果顯示,DMSO組和侖伐替尼組CAFs中自噬小體(黃色箭頭所示)數(shù)目分別為2.00±1.00、7.67±1.53,兩組相比較差異顯著(t=5.38,P<0.05),見(jiàn)圖2。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DMSO組和侖伐替尼組中CAFs遷移數(shù)目分別為60.00±5.00、26.67±2.52,兩組比較差異有顯著性(t=10.31,P<0.05),見(jiàn)圖3。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DMSO組和侖伐替尼組遷移的CAFs傷口愈合百分比分別為58.00±4.00、21.00±2.00,兩組比較差異有顯著性(t=14.33,P<0.05)。

A:DMSO組,B:侖伐替尼組;結(jié)晶紫染色,10倍

3 討 論

HCC的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率導(dǎo)致HCC患者的長(zhǎng)期存活率不理想[1-2]。因此,進(jìn)一步探究肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制及探究新的治療策略,對(duì)于延長(zhǎng)肝癌患者生存時(shí)間至關(guān)重要[16-17]。肝癌的轉(zhuǎn)移不僅需要肝癌細(xì)胞逃避凋亡信號(hào)及宿主免疫反應(yīng),還需要TME中細(xì)胞間通訊支持,因此目前對(duì)于腫瘤發(fā)病機(jī)制和治療方法的探索重心也逐漸從腫瘤本身轉(zhuǎn)向其所處微環(huán)境,靶向TME的治療方式被寄予厚望,主要有以下幾方面原因:腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞具有遺傳穩(wěn)定性,比易發(fā)生基因突變的腫瘤細(xì)胞更容易靶向治療尋找靶點(diǎn)[18];不同于腫瘤細(xì)胞的獲得性耐藥,靶向腫瘤微環(huán)境的治療可有效減少耐藥風(fēng)險(xiǎn)和腫瘤復(fù)發(fā)。

CAFs是激活的成纖維細(xì)胞,是TME中最主要的基質(zhì)細(xì)胞成分以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的關(guān)鍵來(lái)源,在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用,并且也是潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。目前,針對(duì)靶向CAFs的治療策略研究主要集中為以下3個(gè)方面:通過(guò)靶向特異性表面標(biāo)志物(如成纖維細(xì)胞活化蛋白FAP)去除CAFs、靶向CAF的下游效應(yīng)器和信號(hào)通路、將促腫瘤性CAF的激活狀態(tài)恢復(fù)為相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)或腫瘤抑制型。

侖伐替尼可以通過(guò)靶向阻斷VEGFR2途徑抑制腫瘤血管生成,使腫瘤細(xì)胞饑餓和缺氧,從而導(dǎo)致其嚴(yán)重生長(zhǎng)遲緩甚至死亡。侖伐替尼還可以作用于HCC本身及其TME內(nèi)多種細(xì)胞的多個(gè)靶點(diǎn)[19]。目前侖伐替尼對(duì)肝癌細(xì)胞的直接作用機(jī)制研究較為成熟,但尚未見(jiàn)侖伐替尼對(duì)CAFs的生物學(xué)行為影響的研究。

為探索侖伐替尼對(duì)CAFs生物學(xué)行為的影響,本研究首先分離培養(yǎng)了原代CAFs,通過(guò)免疫熒光染色的方法鑒定CAFs的標(biāo)志物,即平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA,結(jié)果顯示,本研究培養(yǎng)的原代CAFs中α-SMA免疫熒光染色陽(yáng)性率>90%,可以用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序和藥物靶點(diǎn)組學(xué)測(cè)序,本研究發(fā)現(xiàn)DMSO組和侖伐替尼組的CAFs之間的差異基因和差異肽段主要富集在細(xì)胞遷移、自噬等相關(guān)功能和通路上,提示侖伐替尼可能主要通過(guò)影響CAFs的自噬以及遷移的能力,進(jìn)一步影響HCC的進(jìn)展。自噬是一種細(xì)胞組分被運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解的過(guò)程,以保持細(xì)胞成分的基礎(chǔ)周轉(zhuǎn),同時(shí)提供能量和大分子前體[20]。到目前為止,關(guān)于自噬在腫瘤進(jìn)展和抑制中的雙重作用仍然存在著爭(zhēng)議,自噬在腫瘤發(fā)展的不同階段中起著動(dòng)態(tài)的促癌或者抑癌的作用[21]。對(duì)自噬的調(diào)控可以作為腫瘤治療的有效介入策略。本研究結(jié)果顯示侖伐替尼與CAFs自噬相關(guān),并且可能通過(guò)這一途徑抑制了CAFs的促癌作用。

本研究同時(shí)通過(guò)透射電鏡觀(guān)察CAFs,以驗(yàn)證侖伐替尼對(duì)CAFs自噬的誘導(dǎo)作用,transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,侖伐替尼對(duì)CAFs遷移具有抑制作用。根據(jù)已有研究報(bào)道,CAFs可通過(guò)化學(xué)途徑調(diào)節(jié)血管生成、基質(zhì)重塑,分泌能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和抑制腫瘤免疫的細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥因子和生長(zhǎng)因子,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和干細(xì)胞特性(CSCs),從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[22-24]。除此之外,CAFs還可以通過(guò)機(jī)械力的作用,以物理方式對(duì)腫瘤起到協(xié)同轉(zhuǎn)移作用[25]。結(jié)合本研究的結(jié)果,提示侖伐替尼除了直接作用于腫瘤細(xì)胞外,也可以通過(guò)作用于CAFs間接抑制腫瘤進(jìn)展。

綜上所述,本研究首次對(duì)于侖伐替尼處理過(guò)的CAFs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序和藥物靶點(diǎn)組學(xué)測(cè)序,首次發(fā)現(xiàn)了侖伐替尼可誘導(dǎo)CAFs自噬,并抑制其遷移。本研究不僅驗(yàn)證了靶向藥物侖伐替尼除了對(duì)腫瘤細(xì)胞本身的作用之外,而其對(duì)TME的作用也為CAFs靶向治療提供了新思路。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步探索CAFs的特異性靶點(diǎn)及作用機(jī)制,為HCC的治療探索新的方向。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QYFYWZLL27592)。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《赫爾辛基宣言》(1996版)和中國(guó)有關(guān)臨床試驗(yàn)研究規(guī)范、法規(guī)進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

作者聲明：趙梓吟、張斌、韓冰參與了研究設(shè)計(jì);趙梓吟、何明陽(yáng)、關(guān)鴿、蔡金貞參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。