基于線粒體DNA D-loop 全序列的麒麟雞遺傳多樣性研究

李威娜，郭美慧，溫錦添，翁茁先，陳潔波，杜炳旺，黃勛和

（1.嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州 514015；2.廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州 514015；3.廣東省五華三黃雞科技創新中心，廣東 梅州 514015）

【研究意義】麒麟雞，又稱粵西卷羽雞、翻毛雞，是產于我國大陸最南端粵西一帶的特色畜禽品種資源，具有悠久的飼養歷史［1-3］。但麒麟雞因長期沒有受到必要的保護而幾近滅絕。全面摸查麒麟雞保種群體的遺傳多樣性水平和品種，對該品種資源的保護和利用具有重要的科學價值。【前人研究進展】線粒體DNA（mtDNA）D-loop因突變速率快、無重組、含量高等特點，被廣泛應用于家雞遺傳資源評估和歷史追溯［4］。基于mtDNA D-loop 序列研究表明，五華三黃雞保種群具有較高的遺傳多樣性水平，品種的形成可能受北方家雞南遷的影響［5］；廣東省黃雞保持較高的遺傳多樣性水平，品種的形成受到鄰省、北方家雞和東南亞紅原雞的影響［6］。對華東地區11 個地方雞品種的遺傳多樣性和母系起源進行研究，檢測出歐美高產品系的遺傳滲入信號［7］。黃勛和等［8］基于mtDNA D-loop 序列評估了我國南方28個黃雞地方品種的遺傳多樣性水平，結果表明黃雞地方品種存在雜交現象，群體經歷了歷史擴張，提示東南亞和我國西南地區的家雞對我國南方黃雞地方品種的形成有一定的遺傳貢獻。麒麟雞是粵西一帶的特色品種，為保護這一珍稀地方品種資源，2011 年起廣東海洋大學對其開展了系統研究，全面摸清了麒麟雞的生物學特性［9-11］，闡明了麒麟雞卷羽性狀的發育規律［12］、遺傳規律［13］，并揭示了卷羽性狀獨立的分子形成機制［14-15］。

【本研究切入點】目前已形成了以黃羽麒麟雞為主體、白羽麒麟雞和黑羽麒麟雞為特色的資源保護群體。這3 個資源群的主要區別在于羽色，黃羽麒麟雞的羽毛為黃色，白羽麒麟雞屬于隱性白羽類型，黑羽麒麟雞的羽毛為黑色，少部分有烏骨性狀。本研究團隊前期已利用mtDNA D-loop部分序列研究了黃羽麒麟雞的遺傳多樣性，并探討其遺傳起源［16］。但目前黃羽麒麟雞未與周邊地方雞品種進行遺傳比較分析，白羽麒麟雞和黑羽麒麟雞的遺傳多樣性及其與周邊地方雞品種的親緣關系也尚未明確。【擬解決的關鍵問題】本研究利用mtDNA D-loop 全序列研究麒麟雞3 個資源群體的遺傳多樣性，探討麒麟雞與周邊地方雞品種的遺傳關系，以揭示麒麟雞的品種形成歷史。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022 年在廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室開展。90 份麒麟雞（來自黃羽、白羽、黑羽群體各30 份）血液樣品采自廣東盈富農業發展有限公司，其他地方雞血液樣品來自當地保種場，各10 份（表1），均為母雞樣品。血液樣品的基因組DNA 提取采用HiPure Blood DNA Mini Kit 試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2 PCR 擴增與序列測定

mtDNA D-loop全序列PCR擴增引物：L16750，5'-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3'［17］；H1374，5'-TTTCACTGGGATGCGGATACT-3'［18］。PCR 反應體系（30 μL）包括Premix Taq〔寶生物工程（大連）有限公司〕15 μL，正反向引物（20 μmol/L）各0.3 μL，模板DNA 1 μL，滅菌ddH2O 13.4 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火50 s、72 ℃延伸80 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。目標條帶經1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1.3 序列分析

測序序列用軟件Bioedit［19］進行人工校對，以紅原雞mtDNA D-loop 全序列（GenBank 登錄號：NC_007235）作為參考序列，采用MEGA 7.0［20］進行序列比對后，使用DnaSP 6.12［21］定義單倍型，提取變異位點，計算單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及進行中性檢驗（Tajima'sD和Fu'sFs檢驗）。通過NCBI BLAST 功能（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索與麒麟雞單倍型完全匹配的中國地方雞D-loop 全序列。堿基組成分析和群體間的遺傳距離（Kimura 2-parameter 模型K2P）計算應用MEGA 7.0［20］完成。應用軟件MitoToolPy（http://mitotool.kiz.ac.cn/）獲取序列變異信息，然后將序列劃入特定的單倍型類群［18,22］。采用軟件PopART 1.7［23］繪制麒麟雞及其他8 個地方雞品種的mtDNA D-loop 全序列中介網絡圖。

2 結果與分析

2.1 麒麟雞遺傳多樣性分析

麒麟雞 mtDNA D-loop 全序列為1 231～1 232 bp，供試樣本中有72 個在核苷酸位置859 處缺失堿基C。堿基T、C、G、A 的平均含量分別為33.7%、26.5%、13.3%、26.5%，T+A 的平均含量（60.2%）高于C+G 的平均含量（39.8%）。通過90 份麒麟雞樣品共檢測到45 個變異位點，占總分析位點的3.65%，其中多態位點43 個、簡約信息位點29 個、單一位點突變14 個。以紅原雞mtDNA 序列NC_007235 作為參考，在麒麟雞45個變異位點中定義了17 個單倍型，其中獨享型單倍型9 個、共享型單倍型8 個（表2）。黃羽麒麟雞的單倍型數量最多（12 個），白羽麒麟雞次之（7 個），黑羽麒麟雞最少（5 個）。在其他8個地方雞品種中，共定義了19 個單倍型，其中河田雞的單倍型數量最多（8 個），寧都黃雞最少（3個），沒有發現與麒麟雞共享的單倍型。通過搜索中國家雞D-loop 全序列發現，與麒麟雞單倍型2、3、8 和14 序列完全一致的地方雞品種，主要有金湖烏骨雞、竹鄉雞、略陽烏雞、綠耳烏雞、仙居雞、崇仁麻雞、白耳黃雞、江邊雞、平鋪麻黃雞、藏雞等（表2）。

表2 麒麟雞和8 個地方雞品種的mtDNA D-loop 單倍型及其在不同群體的共享單倍型數量Table 2 mtDNA D-loop haplotypes and number of shared haplotypes in Qilin chickens and 8 indigenous chicken breeds

麒麟雞總體單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.773±0.039 和0.00630±0.00054（表3）。3 個麒麟雞群體中，黃羽麒麟雞遺傳多樣性最高，黑羽麒麟雞最低。在麒麟雞周邊8 個地方雞品種中，河田雞的遺傳多樣性最高，寧都黃雞最低（表3）。然而，麒麟雞的核苷酸多樣性明顯高于其他8 個地方雞品種。中性檢測結果顯示，9 個雞種的檢測值差異均不顯著，但黑羽麒麟雞的Fu'sFs和Tajima'sD值均差異顯著。

表3 麒麟雞和8 個地方雞品種的mtDNA D-loop 遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of mtDNA D-loop of Qilin chicken and 8 indigenous chicken breeds

9 個雞品種間的K2P 遺傳距離介于0.002～0.009 之間，麒麟雞與其他8 個地方雞品種的遺傳距離均大于其他8 個地方雞品種間的遺傳距離；品種間的凈遺傳距離為0～0.005，麒麟雞與8 個地方雞品種的凈遺傳距離均大于其他8 個地方雞品種間的凈遺傳距離（表4）。

表4 麒麟雞和8 個地方雞品種的群體間遺傳距離Table 4 Genetic distance among populations of Qilin Chicken and 8 indigenous chicken breeds

2.2 麒麟雞遺傳進化分析

以麒麟雞和8 個地方雞品種的mtDNA D-loop全序列構建中介網絡圖（圖1），36 個單倍型可劃分為單倍型類群A、B、C 和E，其中A、B、E是優勢單倍型類群，C 只有1 個單倍型。麒麟雞獨享17 個單倍型，歸屬于單倍型類群A、B、C和E，頻率分別為1.1%（1/90）、30.0%（27/90）、4.4%（4/90）和64.4%（58/90），B 和E 為優勢單倍型類群；黃羽麒麟雞和白羽麒麟雞獨享單倍型最多，各4 個。其他8 個地方雞品種共有19 個單倍型，歸屬于單倍型類群A 和B，頻率分別為75.0%（60/80）和25.0%（20/80），其中12 個為單個品種的獨享單倍型，文昌雞占4 個。

圖1 麒麟雞和8 個地方雞品種mtDNA D-loop 單倍型的中介網絡圖Fig.1 Median network of mtDNA D-loop haplotypes of Qilin chicken and 8 indigenous chicken breeds

3 討論

mtDNA D-loop 全序列分析表明，總體上麒麟雞保持相對較高的遺傳多樣性水平，核苷酸多態性明顯高于本研究供試的其他8 個地方雞品種，也高于江西、浙江、山東等地方雞的核苷酸多態性［7］，這可能與其尚未開展系統選育有關。麒麟雞有著1 000 多年的飼養歷史，但長期未受到足夠重視，2011 年起由廣東海洋大學研究團隊開始了較為系統的研究，同步開展了麒麟雞提純復壯和初步選育。在選育過程中，出現了部分白羽和黑羽的麒麟雞后代，在此基礎上逐步擴大白羽和黑羽麒麟雞群體數量，形成了以黃羽麒麟雞為主體、白羽麒麟雞和黑羽麒麟雞為特色的資源群體。麒麟雞3 個資源群體的遺傳多樣性與其群體數量呈正相關，黑羽麒麟雞的群體數量最少，因此單倍型數量和核苷酸多態性均最低。與2016 年有關麒麟雞mtDNA D-loop 部分核苷酸序列（1～524）遺傳多樣性［16］的研究結果相比較發現，黃羽麒麟雞的單倍型多樣性、核苷酸多樣性分別為0.628±0.063 和0.00859±0.00114，雖然單倍型多樣性略有下降，但核苷酸多樣性有所提高，說明黃羽麒麟雞保種群體較為穩定。

地方品種的形成是自然環境和人文歷史綜合選擇的結果［24］。雖然本研究供試的周邊地方雞品種樣品較少，但麒麟雞的17 個單倍型全部為獨享型，不與其他8 個地方雞品種共享，說明麒麟雞具有相對獨立的品種形成歷史。麒麟雞在粵西尤其在茂名一帶備受民眾喜愛，但在其他地區的銷售量則有限。麒麟雞的卷羽是不完全顯性遺傳性狀［14-15］，分為全卷和半卷兩種類型，從外觀上容易與片羽類型區分。從遺傳距離可以看出，麒麟雞與其他地方雞的遺傳交流較小，這可能是麒麟雞保持獨特性狀和遺傳特性的重要原因之一。在我國其他地區也有一些羽毛外翻的地方雞，如貴州倒毛雞［25］、湖南永順倒毛雞［26］、浙江開化翻毛雞［27］、云南怒江翻毛雞［28］等，均生長在我國南方地區，卷羽性狀與其散熱功能相吻合。這些卷毛雞都是在本地雞群體中發現少量卷羽個體后，經過擴群和本地選育而來，推測不同卷羽雞品種的形成是獨立事件。通過擴大比對范圍發現，歸屬于單倍型類群B、C 和E 的4 個麒麟雞單倍型與國內部分地方雞品種一致［18,29］，并且不少為烏骨雞品種，這可能使部分麒麟雞有烏骨性狀，也說明了麒麟雞是由本土品種選育而來。后續還需擴大樣品收集范圍，利用基因組重測序等分析技術以進一步研究麒麟雞的品種形成歷程。

根據線粒體基因組的劃分方法，可將全球家雞和原雞劃分為A～I 和V～Z［18,30-31］。特定的單倍型類群有特定的區域分布，如A、B 和C 在東亞家雞是優勢單倍型類群，D 主要在東南亞和太平洋地區分布，E 則全球廣泛分布，G 主要在我國西南家雞中分布［8,18,31］。mtDNA D-loop 全序列中介網絡圖將麒麟雞劃分為單倍型類群A、B、C和E，可認為麒麟雞具有4 個母系來源。我國地方雞品種主要以B 為優勢單倍型類群［8］，而麒麟雞為E。值得注意的是，E 在中快速型肉雞以及高產蛋雞中是絕對優勢單倍型類群［32-33］。鑒于麒麟雞體型明顯大于其他地方雞品種，麒麟雞在品種形成過程中是否有外來血源滲入仍有待進一步研究。

4 結論

本研究利用mtDNA D-loop 控制區全序列對麒麟雞進行遺傳多樣性分析，黃羽麒麟雞、白羽麒麟雞和黑羽麒麟雞的單倍型多樣性分別為0.777、0.816、0.710，核苷酸多樣性分別為0.00699、0.00662、0.00546，其中黃羽麒麟雞多樣性最高，且核苷酸多態性明顯高于周邊8 個地方雞品種，表明保種效果良好。麒麟雞有4 個單倍型類群來源，且B 和E 是優勢單倍型類群，而8 個地方雞品種單倍型類群主要為A 和B，表明麒麟雞保持相對較高的遺傳多樣性水平。麒麟雞17 個單倍型不與周邊地方雞品種共享，但4 個單倍型與國內烏骨雞等品種共享，這一發現佐證了該品種的遺傳獨特性，為麒麟雞的品種形成研究提供了新視角。