菜心群體中AUF2 基因的遺傳變異及其與農藝性狀的關聯分析

黃依琳，許玉富，李榮華，李光光，張 華，郭培國，夏巖石

（1.廣州大學生命科學學院作物抗逆國際合作研究中心，廣東 廣州 510006；2.廣州市農業科學研究院，廣東 廣州 510308）

【研究意義】菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee）是十字花科蕓薹屬白菜亞種中以花薹為產品的一個變種，營養價值高，風味獨特，已經成為華南地區人們日常飲食中必不可少的蔬菜種類［1］。隨著消費者對其品質要求的提高，選育性狀優良的菜心品種已成為當前主要的研究方向。通過分析候選基因的自然變異對菜心生長發育的影響，挖掘其優異等位基因，可為菜心分子輔助育種提供理論參考，加快優良菜心品種的選育。【前人研究進展】Auxin Up-regulated F-box protein（AUF）基因是一類生長素上調的F-box 蛋白基因，在陸生植物中廣泛分布，包含AUF1和AUF2兩個同源基因，研究顯示其通過調控生長素與細胞分裂素在根的分布而促進擬南芥根系的延長［2］。F-box 蛋白家族是一類含有F-box 基序（motif），在泛素介導的蛋白質水解過程中具有底物識別特性的蛋白質，參與植物的生長發育過程和激素的信號轉導途徑，也在植物的逆境和防御反應中發揮重要功能［3］。Rameneni 等［4］在大白菜的蛋白數據庫中鑒定出571 個F-box 蛋白基因，其中69 個基因在非生物脅迫條件（寒冷、干旱和鹽脅迫）下差異表達，446 個基因在特定組織（愈傷組織、根、葉、莖、花和角果）中表達。在油菜［5-6］和芥蘭［7］研究中，也證實F-box 蛋白基因與作物的抗病、抗鹽脅迫、器官生長和花期等性狀存在顯著的相關性。Ikram等［8］通過轉錄組分析發現，高溫脅迫后菜心葉片中有27 個F-box 蛋白基因表達水平差異顯著，其中AUF2基因表現出顯著的下調，其可能對菜心的高溫脅迫產生響應。目前，關于AUF2基因在菜心生長發育過程中的生物學功能未見詳細的報道?！颈狙芯壳腥朦c】檢測候選基因在自然群體中具有多態性，通過關聯分析有助于闡釋相關基因的生物學功能，挖掘其優異等位基因可應用于作物的遺傳育種［9］。Mao 等［10］對262 份玉米自交系材料中的ZmNAC111基因進行測序和關聯分析，發現一個長度為82 bp 的InDel 與種子存活率顯著相關，表型解釋率為7.27%；唐婧泉等［11］檢測了SnRK基因家族在530 份油菜材料的多態性，發現14 個SNP 位點與種子含油量顯著關聯，表型解釋率最高達到12.95%，構成的優異單倍型材料種子含油量平均達42%；許德蓉等［12］在110 份馬鈴薯材料中檢測到StDRO1基因的6 個SNP 與馬鈴薯根系性狀顯著關聯，構成的優異單倍型根系性狀與其他單倍型的差異更顯著。【擬解決的關鍵問題】本研究利用156 份菜心種質材料構建自然群體，通過PCR 擴增和直接測序，分析AUF2基因在自然群體中變異位點，然后與菜心的農藝性狀進行關聯分析，確定AUF2基因在菜心生長發育中的生物功能，挖掘AUF2的優異等位位點和單倍型，為菜心品種的分子輔助選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用156 份菜心種質材料構建自然群體，其中黃綠葉色的材料16 份、深綠葉色的材料83 份和油綠葉色的材料57 份，均來源于廣州市農業科學研究院，部分材料為全國不同地方的商用品種，其余材料為廣州市農業科學研究院在全國范圍內收集的野生種并自行編號（表1）。

表1 供試156 份菜心種質材料—覽表Table 1 List of 156 flowering Chinese cabbage accessions used in this study

所有菜心種質材料于2020 年11 月26 日在廣州大學作物抗逆國際合作研究中心的試驗基地進行種植，采用隨機區組設計，每個品種單獨編號，均勻播種在0.5 m2的種植區域，常規水肥管理和病蟲害防治，待生長至齊口花采收期。參考前人方法［13-15］，每個種質材料避開邊行，選取代表性的5 株植株，對株高、單株質量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量（SPAD 值）等6 個農藝性狀進行測定，其中株高和單株質量是菜心優異品種選擇的主要指標［14］，而最大葉長、最大葉寬、最大柄長和葉綠素含量（SPAD 值）能代表菜心外觀品質的大部分性狀［15］。

1.2 試驗方法

1.2.1AUF2基因的擴增及測序 取菜心的新鮮嫩葉，利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取菜心的DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和SmartSpec plus核酸蛋白檢測儀檢測所提取DNA 的質量和濃度，檢測合格的DNA 樣品稀釋成10 ng/μL 作為后續P CR 擴增的模板。參考Brassica napus（rapa）的AUF2基因序列（XM_013866655.3），利用Primer 5.0 設計3 對具有重疊區域的特異性引物（表2、圖1），擴增156 份菜心種質材料的AUF2基因序列，瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定PCR擴增產物的特異性，做好相關標記后送至生工生物工程（上海）有限公司進行PCR 產物雙向測序。

圖1 AUF2 基因的多態性位點及PCR 擴增區域Fig.1 Distribution of polymorphism sites and PCR amplification region of AUF2 gene

表2 克隆菜心AUF2 基因的引物序列Table 2 Primer sequences used to clone the AUF2 gene of flowering Chinese cabbage

1.2.2 菜心群體中AUF2 基因的多態性分析 使用Mega 6.0 軟件［16］對初始測序結果進行修剪后，拼接156 份菜心種質材料的AUF2基因序列，然后與Brassica napus（rapa）的AUF2基因序列（XM_013866655.3）進行序列比對，利用Geneious 9.0.2 軟件［17］分析可能存在的SNP 等變異位點。核苷酸多樣性、單倍型多樣性、Tajima’s D 值、Fu and Li’s D*值及Fu and Li’s F*值等通過軟件Dnasp 6［18］進行計算。

1.2.3 AUF2 基因的多態性位點與菜心農藝性狀的關聯分析 使用Tassel 5.0 軟件［19］的混合線性模型（Mixed liner model，MLM）對AUF2基因的多態性位點與菜心的6 個農藝性狀進行關聯分析，關聯分析所需群體結構和親緣關系數據來自實驗室前期分析成果［20］，在P<0.01 水平上，統計多態性位點對表型變異的貢獻率（R2）。參考王娟等［21］方法，計算等位變異的表型效應值，獲得與表型性狀顯著關聯多態位點的優異等位變異。

2 結果與分析

2.1 菜心群體主要農藝性狀的變異特征

由表3 可知，菜心的株高、單株質量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量（SPAD值）等6 個農藝性狀在156 個菜心種質材料間都存在明顯差異，變異豐富，變異系數在12.30%～ 77.03%之間，其中，葉綠素含量（SPAD 值）的變異系數最小，單株質量的變異系數最大。6 個農藝性狀的偏度值分別在1.20～ 4.80 之間，表明6 個農藝性狀呈現明顯的右偏離，群體中低于平均值的菜心種質材料較多，其中葉綠素含量（SPAD值）偏度值最小，而單株質量的偏度值最大。

表3 156 份菜心種質材料農藝性狀的變異特征Table 3 Variation characteristics of agronomic traits in 156 flowering Chinese cabbage accessions

2.2 菜心群體中AUF2 基因的核苷酸多態性

通過PCR 擴增和測序分析，顯示AUF2基因在菜心自然群體中存在豐富的自然變異，在2 996 bp 的擴增區內共鑒定出34 個變異位點，包含31個SNP和3個InDel，構成36個單倍型（圖1、表4），其中31 個SNP 中堿基的轉換數和顛換數分別為23、8 個，核苷酸多樣性（π）為0.00503，單倍型多樣性（Hd）為0.780。由表4 可知，上游非編碼區1 498 bp內檢測到26個SNP和2個InDel（均缺失11 bp），構成23 個單倍型，核苷酸多樣性（π）為0.00866，單倍型多樣性（Hd）為0.765；編碼區960 bp 內檢測到5 個SNP（2 個SNP 為同義突變，3 個SNP 為非同義突變）和1 個InDel（缺失23 bp），構成17 個單倍型，核苷酸多樣性（π）為0.00195，單倍型多樣性（Hd）為0.582；下游非編碼538 bp 范圍沒有檢測出變異位點。

表4 菜心群體中AUF2 基因的序列變異參數Table 4 Parameters for the sequence variants of AUF2 gene in flowering Chinese cabbage population

選用Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*等中性檢驗評價基因是否受到選擇作用。在中性進化模型下，這些統計值為零，當統計值為負值通常是由于定向選擇引起，而當統計值為正值時則由平衡選擇引起［22］。由表4 可知，AUF2基因在菜心自然群體中Tajima’s D 值為4.27790，在P<0.001 水平上顯著偏離中性選擇，表明其存在大量中等頻率的等位位點，可能的原因是群體瓶頸效應或平衡選擇；Fu and Li’s D*值和Fu and Li’s F*值分別為2.06339 和3.57745，在P<0.02水平上顯著偏離中性檢測。不同區段的中性檢驗顯示，AUF2基因上游非編碼區顯著偏離中性選擇，但在編碼區偏離中性選擇不顯著。該結果說明，AUF2基因在菜心馴化過程中經受了更大的選擇壓力，可能是選擇的靶標候選基因。

2.3 AUF2 基因的多態位點與菜心農藝性狀的關聯分析

采用Tassel 5.0軟件中的混合線性模型（MLM）對AUF2基因的多態位點與菜心的株高、單株質量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量（SPAD 值）等6 個農藝性狀進行關聯分析，結果顯示有4 個SNP 分別與單株質量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個農藝性狀顯著關聯（P<0.01），其對表型變異的解釋率在5.04%～6.52%之間，平均值為5.69%（表5）。其中SNP_1267 與單株質量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個農藝性狀都顯著相關，對表型變異的解釋率分別為5.43%、6.42%、5.04%和6.52%，優異等位變異為A 堿基，占檢測樣本的頻率為25.00%；SNP_1346、SNP_1461和SNP_1504 等3 個位點都與最大葉柄長顯著相關，對表型變異的解釋率分別為5.30%、5.47%和5.66%，其優異等位變異分別是C、C 和T 等堿基，占檢測樣本的頻率分別為26.28%、28.85%和25.64%。SNP_1267、SNP_1346 和SNP_1461 3 個變異位點位于5'端的非編碼區，SNP_1504 為編碼區的非同義突變，導致其氨基酸由天冬氨酸突變為纈氨酸。

表5 與菜心農藝性狀顯著關聯的SNP 位點Table 5 SNPs loci significantly associated with agronomic traits in flowering Chinese cabbage

在156個菜心種質中，SNP_1267、SNP_1346、SNP_1461 和SNP_1504 等4 個顯著關聯的SNP 位點構成了7 個單倍型（表6），其中單倍型Hap1 由4 個最通常的堿基構成，含110 個種質材料，占總數的70.51%；單倍型Hap2 由4 個優異等位變異構成，含35 個種質材料，占總數的22.44%；其余5 個單倍型為稀有單倍型，其占比均小于5%。與單倍型Hap1 相比，單倍型Hap2的單株質量在P<0.05 水平上顯著增加，最大葉柄長在P<0.01 水平上極顯著提高，而株高、最大葉長、最大葉寬和葉綠素含量（SPAD 值）等4個農藝性狀無顯著差異（表7）。

表6 4 個顯著關聯SNP 位點構成的單倍型Table 6 Haplotypes formed by 4 significantly associated SNPs

表7 2 個主要單倍型對菜心農藝性狀的影響Table 7 Effects of two haplotypes on agronomic traits of flowering Chinese cabbage

3 討論

檢測候選基因內的等位變異，有助于鑒定和分離遺傳多樣性材料中有價值的等位變異。本研究發現AUF2基因在156 份菜心種質群體中存在豐富的自然變異，在2 996 bp 的擴增區內共檢測到34 個變異位點，其中26 個SNP 和2 個InDel分布在上游非編碼區，5 個SNP 和1 個InDel 分布在編碼區。前人研究證實，基因內的不同區域SNP 頻率不同，如編碼區比非編碼區存在更少的SNP 和InDel［23-24］。AUF2基因在菜心群體在中的核苷酸多樣性為0.00503，這一結果略高于甲基化相關基因在白菜和芥藍群體中核苷酸多樣性（0.004558 和0.004352）［25］，顯著高于β-CT亞基編碼基因accD在油菜群體中核苷酸多樣性（0.00009）［26］，這可能與試驗材料的多樣性相關，也反映了基因變異的豐富程度。中性選擇性評價顯示AUF2基因的Tajima’s D 值、Fuand Li’s D*值和Fuand Li’s F*值均顯著偏離中性檢測，其可能是群體瓶頸效應或平衡選擇的結果，前人通過分子標記［27-29］對菜心的多樣性分析也表明菜心種質材料間的遺傳背景較窄，這可能由于菜心僅是白菜的一個變種，起源于我國華南地區，栽培區域的局限及長期系統選育造成了種質資源的親緣關系較近［29］。

對AUF2基因的多態位點與菜心6 個農藝性狀進行關聯分析，結果發現1 個SNP 同時與單株質量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個農藝性狀顯著關聯（P<0.01），還有3 個SNP與最大葉柄長顯著關聯（P<0.01），4 個SNP 對表型變異的解釋率在5.04%～6.52%之間，平均值為5.69%，優異等位位點的頻率達到25%以上，其中3 個SNP 位于5’端的非編碼區，1 個SNP 為編碼區的非同義突變，導致酸性的天冬氨酸變為非極性的纈氨酸，這種單一氨基酸的變化很容易破壞分子內相互作用的復雜網絡，影響蛋白質的折疊方式、穩定性、動力學，并最終影響蛋白質的功能［30］。由4 個優異等位變異構成的單倍型Hap2 在P <0.01 水平上顯著提高最大葉柄長的長度，這可能是AUF2基因促進了細胞分裂素介導的細胞在伸長和分化區擴張的結果［2］。葉柄長是白菜類蔬菜的重要農藝性狀，影響作物的種植密度和外觀品質?？婓w云等［31］研究顯示，結球甘藍的葉柄長由2 對主基因控制，其遺傳率高達90.44%。李威等［32］和章云［33］利用大白菜DH 群體均鑒定到2 個與葉柄長相關的QTL 位點，解釋的遺傳貢獻率在6.29%～ 12.9%之間，劉洋［34］在構建大白菜-菜心染色體片段替換系的基礎上，共檢測到8 個與葉柄長相關的QTL 位點，加性效應在37.32%～ 62.61%之間，他們都在連鎖群A08 上檢測到1 個QTL 位點，這個QTL 位點可能與位于A08 染色體上的AUF2基因存在相互作用來調節白菜類蔬菜葉柄的長度，而關于AUF2基因調控葉柄長的分子機理還需進一步的研究。

4 結論

AUF2基因在菜心群體中存在豐富的自然變異。在2 996 bp 的擴增區內共鑒定出34 個變異位點，其中上游非編碼區1 498 bp 內含26 個SNP和2 個InDel，編碼區960 bp 內含5 個SNP 和1 個InDel，而下游非編碼區538 bp 范圍沒有檢測出變異位點。中性檢測顯示，AUF2基因在菜心自然群體中Tajima’s D 值、Fuand Li’s D*值和Fuand Li’s F*值均顯著偏離中性選擇，其可能是群體瓶頸效應或平衡選擇的結果。關聯分析發現，4 個SNP 位點與菜心的單株質量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個農藝性狀呈顯著相關性（P<0.01），其表型解釋率在5.04%～ 6.52%范圍，4 個優異等位變異構成的單倍型Hap2 能顯著提高菜心的單株質量和最大葉柄長。這些優異等位變異和單倍型可為菜心品種的遺傳改良提供參考。