中醫(yī)藥改善肝動脈栓塞綜合征的用藥規(guī)律分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

萬子璇， 李娜， 盧冬彥， 葉小衛(wèi)

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510000

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）作為一種臨床常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，以其高發(fā)病率及高死亡率為特點，位居我國惡性腫瘤死亡原因的第二位[1]。由于肝癌早期不容易被發(fā)現(xiàn)，大部分病人確診時已到中晚期，因此對于不能進(jìn)行手術(shù)切除的肝癌中晚期患者來說，其首選治療手段為血管造影下經(jīng)肝動脈栓塞術(shù)（Transcatheter arterial chemoembolization，TACE）。然而，93.4%的TACE術(shù)后患者會出現(xiàn)不同程度的肝動脈栓塞術(shù)后綜合征（post-hepatic artery embolization syndrome，PES）[2]，如惡心嘔吐、肝區(qū)疼痛、低熱等[3]，這些不良反應(yīng)不僅會顯著惡化患者的生活質(zhì)量，甚至?xí)?dǎo)致一部分患者對后續(xù)化療產(chǎn)生抗拒。目前，PES的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由組織缺血和化療栓塞引起的炎癥反應(yīng)共同引起的[4]。有學(xué)者認(rèn)為，TACE 是以犧牲肝功能來換取腫瘤的殺滅[5]，所以如何減輕介入治療后所導(dǎo)致的不良反應(yīng)，將成為臨床研究的關(guān)鍵。西醫(yī)對PES 尚無系統(tǒng)診療指南，而中醫(yī)對于治療TACE 術(shù)后PES 有獨特優(yōu)勢，能通過辨證論治發(fā)揮增效減毒的作用。故本研究通過數(shù)據(jù)挖掘分析中醫(yī)藥辨證治療PES的用藥規(guī)律，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討其可能的機(jī)制，為臨床中醫(yī)治療PES 提供參考，以期提高TACE治療效果。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以“中醫(yī)”“中藥”“TACE 術(shù)后”“肝動脈栓塞術(shù)后”“化療栓塞綜合征”為主題詞，以中國知網(wǎng)為例，設(shè)定檢索式為（主題=“中醫(yī)”O(jiān)R 主題=“中藥”）AND（主題=“TACE 術(shù)后”O(jiān)R 主題=“肝動脈栓塞術(shù)后”O(jiān)R 主題=“化療栓塞綜合征”），檢索1980年1月至2022年4月期間中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、維普中文期刊、生物醫(yī)學(xué)四大數(shù)據(jù)庫相關(guān)文獻(xiàn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①采用中醫(yī)或中藥治療原發(fā)性肝癌肝動脈栓塞化療術(shù)后綜合征，且報道為治療有效（P＜0.05）的臨床研究文獻(xiàn)；②主要選用臨床隨機(jī)對照研究、臨床觀察。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①疾病診斷為肝內(nèi)膽管癌相關(guān)文獻(xiàn)；②重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；③內(nèi)服藥物組成和劑量不明的文獻(xiàn)；④采用針灸相關(guān)治療的文獻(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選，得到符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)105 篇，包含中藥復(fù)方105 個。根據(jù)2020 版《中華人民共和國藥典》，規(guī)范化處理納入復(fù)方的中藥名稱：①統(tǒng)一化藥物別名或俗稱；②將除炒炭外的炮制方法、產(chǎn)地名稱省略；③合并統(tǒng)一中藥的名稱。如將北芪規(guī)范為黃芪，云苓規(guī)范為茯苓，法半夏、法夏統(tǒng)稱為半夏等。

1.5 數(shù)據(jù)錄入

將規(guī)范后的105條中藥復(fù)方組成數(shù)據(jù)，并進(jìn)行查對，隨后將數(shù)據(jù)輸入到中醫(yī)傳承計算平臺V3.0軟件，為了防止出現(xiàn)重復(fù)、錯輸及遺漏等情況，采取雙人錄入的方式。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用中醫(yī)傳承計算機(jī)平臺V3.0 軟件對中藥復(fù)方數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘處理，對中藥方劑中的藥物頻次、四氣、五味、歸經(jīng)、功效進(jìn)行描述統(tǒng)計。通過關(guān)聯(lián)規(guī)則進(jìn)行聚類分析，探索處方規(guī)律并挖掘出核心藥物組合。

1.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.7.1 核心藥物活性成分及靶點預(yù)測

使用數(shù)據(jù)挖掘得到的頻次前五位的藥物，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），檢索甘草、白術(shù)、茯苓、柴胡、黨參的藥物活性成分，設(shè)置口服利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30，類藥性（Drug-likeliss，DL）≥0.18，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索藥物篩選后活性成分的蛋白靶點。

1.7.2 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

通過Genecards 疾病數(shù)據(jù)庫檢索“Post embolization syndrome” 獲取疾病靶點， 使用Venny2.1.0（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得藥物與疾病交集靶點，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 與藥物成分建立疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，然后將交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interactions，PPI）數(shù)據(jù)，最后輸入Cytoscape3.8.2，生成PPI最終的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7.3 GO及KEGG富集分析

將藥物-疾病共同靶點利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的富集分析。并使用“微生信”平臺，繪制出可視化的分析圖。

1.8 分子對接

將PPI 網(wǎng)絡(luò)圖和數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，通過Degree、Betweenness、Closeness標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，獲取核心靶點，將疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中Degree 值排名前4 位的有效成分，與核心靶點導(dǎo)入AutoDock進(jìn)行分子對接，通過PyMol對結(jié)果實現(xiàn)可視化顯示。

2 結(jié)果

2.1 中藥使用情況

納入中藥復(fù)方105 首，共涉及181 味中藥。其中使用頻數(shù)≥30 次的高頻藥物共8 味，分別為甘草（75 次）、白術(shù)（60 次）、茯苓（59 次）、柴胡（55 次）、黨參（44 次）、白芍（43 次）、黃芪（38 次）、半夏（33次）。

2.2 四氣五味和歸經(jīng)分布情況

同一藥物的不同性味歸經(jīng)均進(jìn)行統(tǒng)計。藥物四氣以寒、熱、溫、涼劃分，寒性藥物頻次最高，溫性及平性藥物次之。寒性藥占比為37.74%，溫性藥占比為32.19%，平性藥占比為25.25%，涼性藥占比3.79%，熱性藥占比1.02%。

藥物五味以酸、苦、甘、辛、咸劃分，以苦味藥居多，甘味藥次之。苦味藥占比35.33%，甘藥占比34.53%，辛藥占比22.36%，酸藥占比5.81%，咸藥占比1.98%。

分析藥物歸經(jīng)，可見藥以脾經(jīng)、肺經(jīng)、肝經(jīng)作為主要歸經(jīng)為主，分別占比23.1%、19.34%、14.38%。

2.3 中藥功效

對藥物功效進(jìn)行統(tǒng)計，其中補虛類中藥為頻次最高，占比35.06%。

2.4 組合頻次及關(guān)聯(lián)規(guī)則

使用“組方規(guī)律”模塊，采用規(guī)則分析，并設(shè)置支持度個數(shù)為20（支持度=支持度個數(shù)/總處方數(shù)量*100%），置信度為0.7，得到組合41 個，可見核心藥物組合41 個，頻次最高為“甘草、柴胡”疏肝健脾組合，其次為“甘草、白術(shù)”健脾補氣組合，頻次≥25 的前14 個藥物組合詳見表1。運用關(guān)聯(lián)規(guī)則對以上常用藥物組合進(jìn)行分析，即藥物A與藥物B組合使用的次數(shù)越多，則關(guān)聯(lián)度越大，出現(xiàn)概率居前10位的結(jié)果見表2。

表1 核心藥物組合Table 1 Combination of core drugs

表2 關(guān)聯(lián)規(guī)則Table 2 Association rule analysis

2.5 聚類分析

使用聚類分析，設(shè)置聚類個數(shù)為3，將納入的105 個中藥復(fù)方分為3 組。核心組合①：甘草，茯苓，當(dāng)歸，白術(shù)，柴胡。核心組合②：甘草，柴胡，半夏，赤芍，白芍。核心組合③：甘草，茯苓，白術(shù)，黨參，柴胡。

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.6.1 繪制疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

于TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索并篩選核心組合②主要成分，共獲得135種活性成分，通過Genecards數(shù)據(jù)庫檢索“Post embolization syndrome”獲取1315 個疾病靶點，將成分靶點與疾病靶點取交集，獲取111個共同靶點，并將之導(dǎo)入Cytoscape3.8.2，繪制疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1，將PPI 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，導(dǎo)出相關(guān)數(shù)據(jù)，篩選出Degree、Betweenness 值均大于2 倍平均值、Closeness 值大于平均值的靶點，獲得AKT1、IL6、TNF、IL1B 4個核心靶點，見表3。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Protein-protein interactions network

表3 核心靶點信息Table 3 information of core targets molecular

2.6.2 GO及KEGG分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對GO 和KEGG 進(jìn)行富集分析，GO 富集顯示靶點主要集中在膜筏、細(xì)胞外空間和細(xì)胞表面，主要參與基因表達(dá)正調(diào)節(jié)、對雌二醇的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)等生物學(xué)過程，主要參與酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性等分子功能。根據(jù)P 值大小對GO 富集前10 條進(jìn)行可視化展示，見圖3。KEGG 富集通路主要涉及IL-17、TNF、HIF-1 信號通路等。選擇P值最小的前20 條，進(jìn)行可視化展示，見圖4。

圖3 GO分析氣泡圖Figure 3 GO functional enrichment analysis bubble diagram

圖4 KEGG富集氣泡圖Figure 4 KEGG pathway enrichment analysis column diagram

2.7 分子對接

從疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中篩選出度值前4 的藥物成分，分別為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、黃芩素。將以上藥物小分子分別與核心靶點AKT1、IL6、TNF、IL1B 通過Autodock1.5.6 進(jìn)行分子對接，其結(jié)合能均能小于-6.0 kcal·mol-1，關(guān)鍵活性成分靶點結(jié)合活性良好，具體結(jié)合能見表4。選取結(jié)合能絕對值最大并能形成氫鍵者β-谷甾醇與TNF 通過Pymol 軟件繪圖進(jìn)行可視化展示，見圖5。

圖5 分子對接可視化展示Figure 5 Core compounds and core targets molecular docking visualization

表4 分子對接驗證結(jié)果Table 4 Molecular docking verification results

3 討論

原發(fā)性肝癌在中醫(yī)中屬于“黃疸”“肝積”“積聚”等范疇，而其多由于肝氣郁結(jié)、飲食損傷、感受邪毒等所致正氣虧虛、臟腑失調(diào)，治法宜護(hù)益脾氣、滋養(yǎng)肝陰、資腎水以息肝火[6]。有學(xué)者[7]認(rèn)為TACE 術(shù)后PES 證型可分為“邪實”和“正虛”兩端，邪實主要包括氣滯、濕熱、濕濁、血瘀等，正虛主要為脾胃虛弱和肝腎陰虛，緣因TACE 的主要作用機(jī)制為通過導(dǎo)管插入等手段，于腫瘤的重要血管中注入大量化療藥物以及栓塞劑，從而實現(xiàn)對癌細(xì)胞的直接化療以及切斷癌細(xì)胞血液供應(yīng)的功能[8]，在中醫(yī)范疇中屬于祛邪法，中醫(yī)藥的辨證治療可作為祛邪法的補充以改善肝功能及全身狀況[9]。臨床研究證明，中藥可通過疏肝健脾、理氣化痰、利膽和胃、解毒化瘀、益氣和血等治法改善TACE 術(shù)后的不適癥狀，以提高患者生活質(zhì)量[10-13]。如參桃軟肝丸結(jié)合羥基喜樹堿栓塞化療能夠減輕TACE 術(shù)后肝功能損害[14]，以達(dá)到“保肝抑瘤”的目的。

數(shù)據(jù)挖掘所得中藥主要以補虛藥為主，可見TACE 術(shù)后PES 多為虛證。其中甘草、白術(shù)、黨參、黃芪俱為甘潤之品，可補益肺脾之氣；柴胡歸肝膽經(jīng)，可疏肝解郁，又可退其內(nèi)熱，助其升發(fā)陽氣；白芍酸味之藥，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰柔肝，能止肝區(qū)疼痛；半夏辛溫，可燥濕化痰又降逆止嘔；茯苓甘淡，《藥品化義》言其甘淡則能補能滲，既補脾陰又益肺氣[15]。 從藥物歸經(jīng)來看，歸于脾、肺、肝經(jīng)的中藥最多。由于先后天的各種因素導(dǎo)致脾腎虧虛，不能運化，則氣滯、血瘀、水停，積聚之病生，故運用健脾益氣藥物，脾能健運，氣機(jī)通暢，病邪乃解。肝主宣發(fā)，肺主肅降，一升一降，氣機(jī)乃暢，肝病多有氣滯，常常影響到肺，兩者互為因果，故運用入肺經(jīng)藥物，佐金平木，使肝肺相和。

其中第二類核心組合為甘草、柴胡、半夏、赤芍、白芍，其中柴胡、半夏、甘草有小柴胡湯之義，出自《傷寒雜病論》，主治傷寒少陽證，方中柴胡入肝膽經(jīng)，為君藥，疏泄氣機(jī)，驅(qū)散少陽半表之邪。半夏性辛溫，降逆止嘔，“治吐食反胃，霍亂轉(zhuǎn)筋”[16]。又赤芍苦寒，既涼血散瘀又能止痛，TACE 術(shù)后多肝區(qū)疼痛，繆希雍言赤芍“入肝家血分，主邪氣腹痛”[17]，認(rèn)為赤芍能攻堅破積、破除瘀血。加之組合中白芍柔肝養(yǎng)陰；兩芍相加，能破除惡血，促新血生。潘攀等[18]通過臨床研究證明小柴胡湯能有效地預(yù)防及治療PES。郝穎等[19]通過臨床觀察，證實小柴胡湯聯(lián)合TACE 術(shù)能改善原發(fā)性肝癌的癥狀，顯著降低甲胎蛋白水平，提高患者健康狀況。鄒增城等[20]發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯聯(lián)合茵陳蒿湯可以改善肝功能，緩解PES 的肝區(qū)疼痛，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)信號通路上下游分子的表達(dá)與氧化應(yīng)激有關(guān)[21]。

目前對于PES，其發(fā)生機(jī)制并不完全明確，推測其可能與腫瘤壞死與正常肝細(xì)胞損傷有關(guān)[22]。高濃度的化療藥物在作用于局部病灶會使肝組織急性缺血缺氧，肝功能損傷，血管痙攣導(dǎo)致肝區(qū)疼痛，術(shù)后腫瘤壞死產(chǎn)生炎性物質(zhì)，如腫瘤壞死因子、前列腺素，白介素，生長因子，干擾素等[23]，作為內(nèi)源性發(fā)熱源導(dǎo)致發(fā)熱，其使用的化療藥物如鉑類藥物可能通過刺激胃腸道而引起患者惡心不適，甚至出現(xiàn)嘔吐癥狀，或通過刺激膈神經(jīng)導(dǎo)致膈肌痙攣導(dǎo)致呃逆不止[24]。經(jīng)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)篩選，發(fā)現(xiàn)其核心組成成分為槲皮素，山奈酚，β-谷甾醇，黃芩素。槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種功能，能通過阻斷NF-κ B 信號途徑，減少炎癥因子的釋放，增強機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力[25]。有研究表明，山奈酚可通過抑制機(jī)體轉(zhuǎn)氨酶的升高，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥反應(yīng)來減輕急性肝損傷[26]，同時山奈酚有助于下調(diào)PI3K/AKT/mTOR 通路，從而發(fā)揮對肝癌的治療作用[27]。黃芩素作用廣泛，徐雯星等[28]研究者發(fā)現(xiàn)，黃芩素對氧化應(yīng)激的肝損傷模型具有保護(hù)作用，同時，在靜脈注射長春新堿誘導(dǎo)的靜脈炎家兔模型中，通過抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和NF-κB 通路的失活，降低炎癥因子水平，減少血管內(nèi)皮的損傷[29]。β-谷甾醇是一種來源于植物性食物的天然活性物質(zhì)，其衍生物2-萘甲酰Sit酯（Sit-N）可抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）的產(chǎn)生，發(fā)揮對急性肝損傷的保護(hù)作用[30]。Wong 等[31]發(fā)現(xiàn)使用β-谷甾醇預(yù)處理肝毒性小鼠，可以減輕其氧化應(yīng)激損傷。同時，王凱等[32]通過實驗證實β-谷甾醇可通過阻斷細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)來抑制肝癌細(xì)胞的增殖。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得的核心靶點為AKT1、IL6、TNF、IL1B等。AKT 又稱作蛋白激酶B 或PKB，參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄、代謝、凋亡以及蛋白質(zhì)合成等過程，同時又作為磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的下游蛋白，許多抗腫瘤藥物能通過抑制PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮顯著作用[33]。藥物也能通過阻斷PI3K/AKT/mTOR 信號途徑，抑制細(xì)胞炎癥因子IL-6，TNF-α的合成和分泌[34]，從而發(fā)揮抗炎作用。IL-6可誘導(dǎo)多種急性炎癥蛋白的表達(dá)，屬于促炎因子的一員[35]，有研究顯示，TACE 術(shù)后患者血清IL-6 水平顯著高于沒有PES 的患者[36]。腫瘤壞死因子（TNF）作為一種重要的細(xì)胞因子，常參與全身炎癥過程[37]，其受體之一TNFR1 能激活NF-κB、c-Jun、MAPK 通路，從而引起各種經(jīng)典促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，有研究證明，中藥可通過降低白介素-2（Interleukin- 2，IL-2）、IL6、TNF-α 等炎癥因子的水平改善肝癌炎癥微環(huán)境，從而減少PES 的發(fā)生[38]。KEGG 富集分析結(jié)果表示核心處方主要涉及白介素-17（Interleukin- 17，IL-17）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia-Inducible Factor 1，HIF-1）、TNF 信號通路改善PES，IL-17 信號通路主要涉及炎癥過程，有研究顯示，在過氧化氫誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞缺氧模型中，下調(diào)IL-17 可減少肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激[39]。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1在各種缺氧組織中常顯著增加[40]，HIF-1 信號通路的激活，可誘導(dǎo)下游蛋白血管內(nèi)皮生長因子和促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生，發(fā)揮對缺氧細(xì)胞的保護(hù)作用[41]，推測該核心組合可能通過抑制IL-17 通路的表達(dá)，上調(diào)HIF-1 通路，抑制炎癥因子IL-6、TNF 等炎癥因子的產(chǎn)生，同時保護(hù)缺氧的肝細(xì)胞，從而改善PES。

綜上，肝癌PES 證型眾多，易兼雜他證，但在臨床治療上仍有一定規(guī)律，患者多有脾虛之證，同時兼有肝郁氣滯、瘀毒、痰熱、陰虛等，治療上多以補脾益氣為主，兼以益陰、疏肝理氣、化瘀解毒、清熱化痰等，中醫(yī)藥改善PES 通過多通道、多靶點發(fā)揮治療作用。本研究通過對運用中醫(yī)藥治療PES 的臨床研究進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，篩選出105個中藥復(fù)方作為研究內(nèi)容，在一定程度上可以反映臨床治療肝癌PES 的用藥規(guī)律，分析結(jié)果對臨床治療PES 有一定的參考價值，但其療效待進(jìn)一步臨床研究的驗證。