牛樟葉總多糖提取物減輕衰老小鼠認知障礙的作用研究

張蓓 徐宏

【摘 要】 目的： 研究牛樟葉總多糖減輕衰老小鼠認知障礙的作用。方法：6月齡60只昆明小鼠，隨機分為空白組、模型組、陽性組鹽酸多奈哌齊片（0.3 mg/100 g）、牛樟葉總多糖提取物給藥組（58 mg/100 g、46.4 mg/100 g、29 mg/100 g）。采用腹腔注射D-半乳糖方法制備衰老動物模型，連續注射給藥40 d，于第11天開始給予相應劑量的藥物，第36天進行Morris 水迷宮考察小鼠行為學實驗，給藥結束后，用水合氯醛麻醉后處死取材，采用酶標儀按試劑盒說明書檢測腦勻漿丙二醛（MDA）水平、小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷光甘肽（GSH）水平、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），采用HE染色觀察小鼠海馬組織形態學改變情況。結果：與模型組相比，牛樟葉提取物各劑量組能不同程度降低小鼠腦勻漿中MDA水平，升高小鼠血清中SOD、GSH、GSH-Px水平，牛樟葉總多糖提取物組認知功能有所提高，與模型組比較，陽性藥物組和牛樟葉總多糖各劑量組小鼠海馬組織CA1區神經細胞排列較整齊，結構相對正常，核濃染和固縮的程度降低。結論：牛樟葉總多糖有一定的抗衰老減輕認知障礙的作用，作用機制可能與其抗氧化作用有關。

【關鍵詞】 總多糖；抗衰老；認知障礙

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2023）09-0020-05

Abstract：Objective To study the effect of total polysaccharide from cinnamomum cinnamomum leaves on reducing cognitive impairment in aged mice.Methods Sixty Kunming mice aged 6 months were randomly divided into blank group， model group， positive group， donepezil hydrochloride tablet （0.3 mg/100 g）， and cinnamomum cinnamomum leaves polysaccharide extract administration groups （58 mg/100 g， 46.4 mg/100 g， 29 mg/100 g）. The aging animal model was prepared by intraperitoneal injection of D-galactose for 40 days. On the 11th day， the corresponding dose of the drug was given. On the 36th day， the Morris water maze experiment was conducted to investigate the behavior of the mice. The level of malondialdehyde （MDA） in brain homogenate， the level of superoxide dismutase （SOD）， glutamyl glycine （GSH） and glutathione peroxidase （GSH-Px） in serum of mice were detected by microplate plate according to the kit instruction. The morphological changes of hippocampus were observed by HE staining.Results Compared with the model group， each dose group of cinnamomum cinnamomum extract could reduce the level of MDA in rat brain homogenate to different degrees， and increase the levels of SOD， GSH and GSH-Px in serum of mice. The cognitive function of cinnamomum cinnamomum cinnamomum polysaccharide extract group was improved. The nerve cells in the hippocampal CA1 region of mice in the positive drug group and the total cinnamomum cinnamomum polysaccharide groups were arranged neatly and the structure was relatively normal， and the degree of nuclear hyperchromia and pyknosis were reduced. Conclusion Polysaccharide from Cinnamomum cinnamomum leaves has a certain anti-aging effect and alleviates cognitive impairment， and its mechanism may be related to its antioxidant effect.

Keywords：Total polysaccharide; Anti-aging; Cognitive Impairment

衰老分為生理性衰老以及病理性衰老，平常所說的衰老指的是生理性的衰老，是一種無法逆轉的生理過程。衰老的表現形式多樣，除了外在表現，大腦記憶能力的減退是衰老早期的表現之一［1］。機體的氧化應激程度是加劇衰老發生的重要原因之一，可推知具有抗氧化作用的藥物，可能具備一定程度的抗衰老能力。

丙二醛是生物體中脂質過氧化的常見產物之一，在臨床學科中，MDA是脂質過氧化的生物標記，可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度；SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員；GSH能幫助保持正常的免疫系統功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用；GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶［2-5］。本項目檢測給藥后小鼠腦漿及血清中上述因子的變化，以明確牛樟葉總多糖具備增強機體抗氧能力，從而起到延緩衰老作用。

此外，項目組前期已有實驗研究表明牛樟葉水提取物的抗衰老作用［6］，為了進一步明確其發揮作用的物質基礎，對水提取物中的多糖類成分進行了純化富集實驗，以純化后的多糖提取物開展抗衰老作用研究，以期可揭開其抗衰老作用的物質基礎，為牛樟葉的進一步開發奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 動物 實驗動物KM小鼠60只，（20±2）g，清潔級，雄性，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。動物飼養于溫度（23±2） ℃、相對濕度60%～65%、12 h 明暗交替環境，分籠飼養，標準飼料，自由進食飲水。

1.2 藥物 牛樟葉（Cinnamomum camphora leaves）總多糖提取物（25 mg/mL ，批號：20201221，柳州市中醫醫院中藥壯瑤藥制劑研發重點實驗室）

1.3 試劑 鹽酸多奈哌齊片（衛材（中國）藥業有限公司，批號：20200818），D-半乳糖（惠興生化有限公司，批號：120214）。MDA試劑盒（批號：20200213）、 SOD 試劑盒（批號：20190815）、GSH 試劑盒（批號：20190923）、GSH-Px 試劑盒（批號：20190414），以上試劑盒均購自南京建成生物研究所。

1.4 儀器 全波長酶標儀（Epoch Biotek 公司，美國）；ME204E分析電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］； UV1780-5 紫外分光光度計（島津企業管理中國有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組給藥 60只雄性小鼠適應性喂養1 W后，隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組及牛樟葉總多糖高、中、低劑量組，每組10只。

2.2 造模給藥 造模方法參考文獻［7］方法，模型組、陽性給藥組、牛樟葉總多糖各給藥劑量組小鼠每日腹腔注射D-半乳糖生理鹽水溶液2.5 mL/100 g，正常對照組注射同體積的生理鹽水，從實驗第11天開始，灌胃給予牛樟葉總多糖高、中、低劑量組（58.0 mg/100 g、46.4 mg/100 g、29.0 mg/100 g），根據預實驗結果，3個劑量組小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px指標差異有顯著意義（P<0.05），加大給藥劑量無統計學意義，故本次實驗依據預實驗的結果設置三個劑量組比例為2∶1.6∶1），陽性對照組給予鹽酸多奈哌齊片（0.3 mg/100 g），正常對照組及模型組灌胃同體積的蒸留水，每7 d稱體質量1次，依據體質量調整給藥劑量，連續40 d。

2.3 行為學實驗［8］ 從造模第36天開始進行連續5 d的定位航行實驗，在水池中第Ⅱ象限的中心位置放置平臺，每天依次在每個象限訓練每只小鼠，若小鼠60 s內未能找到平臺，則將小鼠引導至平臺上，其潛伏期為60 s，完成逃避潛伏期實驗。在末次定位航行實驗結束24 h后進行1次空間探索實驗，撤掉平臺，隨后將小鼠面向池壁放入水中，入水口選擇平臺對面的象限，時間為60 s，計算平臺象限逗留時間（t3） 與總時間（t總）的比值（%） 。

2.4 小鼠血清的SOD、GSH-Px活性、GSH活性及腦組織勻漿中MDA含量檢測 各組取8 只小鼠，水合氯醛麻醉后眼眶取血，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取上層血清，采用酶標儀按SOD、GSH-Px、GSH、MDA檢測試劑盒說明書檢測GSH-Px、GSH活性及SOD、MDA含量。

2.5 小鼠海馬組織病理學檢查 水迷宮實驗結束后，各組隨機取3只小鼠，水合氯醛麻醉后開胸，暴露心臟，自左心室升主動脈灌注約50 mL生理鹽水，待流出液為無色時，繼以灌注4%多聚甲醛溶液約60 mL至小鼠全身變硬。灌注結束后，剖取小鼠全腦放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規脫水、包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察海馬組織CA1區神經細胞的形態及結構。

2.6 統計學方法 實驗數據均采用SPSS 23.0 統計軟件進行處理，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

1 牛樟葉總多糖提取物對小鼠行為學的影響

1.1 Morris 水迷宮行為學檢測結果（表1） 各組小鼠逃避潛伏期隨訓練天數增加而逐漸縮短。與正常組比較，訓練第5日時，模型組小鼠行動路線仍舊雜亂無章，逃避潛伏期時間明顯延長（P<0.05），逗留平臺象限時間（t3） 占總時間（t總） 的比值減少（P<0.05 ），穿越平臺次數減少（P<0.05）；與模型組比較，給藥組小鼠逃避潛伏期縮短（P<0.05 ），平臺象限逗留時間占總時間的比值增加（P<0.05 ），穿越平臺次數亦增加（P<0.05） 。

1.2 牛樟葉總多糖對衰老小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px水平的影響

1.2.1 牛樟葉總多糖對衰老小鼠對血清SOD、GSH、GSH-Px水平的影響 與正常組相比，模型組血清SOD、GSH、GSH-Px顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，牛樟葉總多糖各劑量組和陽性組SOD、GSH、GSH-Px均顯著升高（P<0.05），結果詳見表2。

1.2.2 牛樟葉總多糖對衰老小鼠腦組織勻漿MDA水平的影響 與空白組相比，模型組MDA水平明顯升高（P<0.05），與模型組相比，陽性給藥組及各劑量給藥組MDA明顯降低（P<0.05），結果見表3。

1.3 牛樟葉總多糖對各組小鼠海馬組織CA1區神經細胞形態學的影響 正常組小鼠海馬組織CA1區神經細胞排列整齊，細胞形態完整、結構正常，細胞質豐富，細胞核與細胞質界限清晰可見、核仁明顯；與正常組比較，模型組小鼠海馬組織CA1區神經細胞核濃染、形態不規則，與模型組比較，牛樟葉總多糖各劑量組小鼠海馬組織CA1區神經細胞排列較整齊，結構相對正常，核濃染和固縮的程度降低。這表明牛樟葉總多糖可有效改善D-半乳糖所致的衰老小鼠海馬組織神經細胞受損，結果如圖1所示。

4 討論

隨著社會向老齡化的趨勢發展，對于抗衰老藥物的需求量越來越大［9-11］，中草藥多成分多靶點的優勢在抗衰老作用上表現出強大的優勢，大量的研究表明，中草藥多糖類、黃酮類成分、皂苷類成分等有明顯的抗衰老活性［12］。課題組前期的實驗結果表明牛樟葉水提取物可延緩小鼠衰老進程，但是發揮作用的物質基礎卻未進一步研究。本文基于前期的實驗基礎，在水提取液的基礎上，研究牛樟葉總多糖的純化工藝，以最大程度富集牛樟葉總多糖成分。課題組采用純化后的牛樟葉總多糖溶液進行灌胃給藥，開展行為學、海馬組織病理學檢查及各細胞因子的檢測實驗，以進一步明確牛樟葉發揮抗衰老作用的有效成分及其作用機制。

由小鼠行為學實驗結果可知，模型小鼠的逃避潛伏期時間明顯延長、穿臺次數明顯減少，給予牛樟葉總多糖藥物干預后，小鼠的上述指標較模型組均有顯著改善，表明小鼠的學習記憶能力得到明顯的提高。

機體衰老過程涉及許多內外因素，活性氧自由基（ROS）是在衰老過程中最常見的內源性生化因子，其能與生物膜中不飽和脂肪酸形成過氧化脂質，引起神經元的損傷，導致機體功能下降，產生記憶能力衰退等衰老癥狀［13］。機體相關抗氧化酶如SOD、GSH-Px、GSH等活性下降使機體清除自由基的能力下降，加速衰老進程［14］。由此可推知，抗衰老的能力在一定程度與抗氧化的能力有關，提高抗氧化能力，有利于延緩衰老［15］。

D-半乳糖誘導的衰老模型同時作為一種腦老化的模型日益得到認可［16］。本研究通過腹腔注射D-半乳糖建造衰老動物模型，從海馬組織的病理檢查結果可知，衰老模型小鼠的海馬組織與正常對照組的形態學上有明顯的差異，而給予牛樟葉多糖藥物干預后，藥物干預組的海馬組織形態學與模型組相比也有明顯的差異，這表明，通過D-半乳糖建造的動物模型可作為腦老化模型，而給予牛樟葉總多糖干預后，腦老化的程度有所減輕。

通過對各組小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px以及腦組織勻漿MDA的檢測結果可知，血清SOD、GSH、GSH-Px的活力，模型組與正常組相比，指標均下降（P＜0.05），牛樟葉總多糖各劑量藥物干預組與模型組相比，指標均上升（P＜0.05），而腦組織勻漿MDA含量，模型組與正常組相比，指標均上升（P＜0.05），牛樟葉總多糖各劑量藥物干預組與模型組相比，指標均下降（P＜0.05）。結果提示牛樟葉總多糖能升高D-半乳糖致衰老小鼠模型血清中SOD、GSH、GSH-Px水平，同時降低MDA的水平，在一定程度上提高了機體清除自由機的能力，削弱了脂質過氧化物對腦組織的損傷作用，從而達到抗衰老的目的。

本實驗初步證實牛樟葉發揮抗衰老作用的活性成分為多糖類成分，而至于是哪一種多糖仍需進一步分離研究。通過對抗氧化酶活性及過氧化物產物MDA的含量檢測結果可推測，牛樟葉多糖確能通過抗氧化作用降低腦內過氧化脂質的含量，起到腦組織的保護作用，進而延緩衰老的發生，至于是通過激活哪條通路發揮作用，有待課題組進一步研究。

參考文獻

［1］陳厚早，劉德培.衰老的基礎研究現狀與干預策略［J］.蚌埠醫學院學報，2018，43（10）：1261-1265.

［2］YANG Z，WANG J，LI J，et al.Antihyperlipidermic and hepatoprotective activities of polysaccharide fraction from Cyclocarya paliurus in high-fat emulsion-induced hyperlipidaemic mice［J］Carbohydrate Polymers，2018，183（3）：111-20.

［3］LIU Y，LI H，SHA Q，et al.Effects of maternal underutrition on the growth，development and antioxidant atatus of ovine placentome subtypes during late pregnancy［J］.Theriogenology，2018，110（4）：96-102.

［4］WU W，WEI W，LU M，et al.Neuroprotective Effect of Chitosan Oligosaccharide on Hypoxic-Ischemic Brain Damage in Neonatal Rats［J］.Neurochemical Research，2017，42（111）：3186-3198.

［5］安紅梅，史云峰，胡兵，等.地黃益智方對D-半乳糖衰老模型小鼠腦組織SA-β-gal活性的影響［J］.中華中醫藥學刊，2011，29（3）：547-549.

［6］張蓓，余瀟苓，覃開羽，等.牛樟葉水提取物對D-半乳糖致衰老模型小鼠的作用機制研究［J］.中國藥業，2021，30（3）：18-21.

［7］黃飛娟，程德金，吳正治，等.阿爾茨海默病病理鼠模型研究進展［J］.醫學綜述，2017，23（6）：588-590.

［8］周勇，劉晶，陳剛.淫羊藿對D-半乳糖誘導的腦衰老模型小鼠p53/p21信號通路的影響［J］.2019，37（9）：2159-2162.

［9］WANG L J，DU J L，ZHAO F Y，et al.Tillium tschonoskii maxim saponin mitigateds D-galactose-induced brain aging of rats through rescuing dysfunctional autophagy mediated by Rheb-mTOR signal pathway［J］.Biomed Phamacother，2018（98）：516-522.

［10］張忠立，左月明.延齡草提取物對異質性及多因性阿爾茨海默病模型小鼠學習記憶與抗氧化能力的影響［J］.中國老年學雜志，2016，36（14）：3362-33364.

［11］詹光杰，黃發軍，肖本見.頭頂一顆珠對D-半乳糖所致小鼠衰老模型的影響［J］.中國現代醫藥雜志，2013，15（10）：1-4.

［12］王子禮，陳顯兵，趙方毓，等.頭頂一顆衰老小鼠認知及海馬BNDF、TrkB的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2020，40（11）：1373-1377.

［13］翟春梅，薛迎鳳，高利權，等.白術對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶和抗氧化能力的影響［J］.中醫藥學報，2021，49（7）：26-31.

［14］范紅艷，顧饒勝，劉師兵，等.苦參總黃酮對D-半乳糖致衰老小鼠的影響［J］.中國中藥雜志，2015，40（21）：4240-4244.

［15］WU C H，WU C F，HUANG H W，et al.Naturally occurring flavonoids attenuate high gulcose-induced expression of proinflammatory cytokines in human moncytic THP-1 cells［J］.Mol Nutr Food Res，2009（53）：984-995.

［16］SHWE T，PRATCHAYASAKUL W，CHATTIPAKORN N，et al.Role of D-galactose-induced brain aging and its potential used for therapeutic inteventions［J］.Exp Gerontol，2018（101）：13-36.

（收稿日期：2022-08-23 編輯：劉 斌）

基金項目：柳州市陽和工業新區應用技術研究開發與科技創新項目合同（2019007）。

作者簡介：張蓓（1984—）女，漢族，碩士，副主任藥師，碩士研究生導師，研究方向為中藥品質評價及活性成分研究。E-mail：zhangbei8402@126.com