非小細胞肺癌患者的血漿miRNA-150水平與臨床特征和血清癌胚抗原水平的關系△

關英，隆玉萍，翟志英

西寧市第一人民醫院呼吸內科，西寧 810003

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是全球惡性腫瘤相關死亡的主要原因之一。多數NSCLC 患者確診時已為局部晚期或已發生轉移，其總體預后較差。NSCLC 患者采取手術切除或根治性放療后具有相對良好的長期預后[1]。早診早治是提高NSCLC 患者生存率和改善預后的關鍵。研究表明，CT 篩查周期差異大、假陽性率高且效益成本比低，血清腫瘤標志物被認為是早期診斷NSCLC 的有效手段[2]。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是廣譜血清腫瘤標志物，參與NSCLC 的發生發展過程，其表達水平可反映病變程度，可作為有前景的腫瘤標志物用于NSCLC 的診斷及病情評估，具有較好的特異度，但其診斷準確度及靈敏度均較低，漏診率和誤診率均較高[3-4]。新興的生物標志物檢測在NSCLC 的篩查中具有一定的潛力。微小RNA（microRNA，miRNA）可作為信使在細胞間傳遞信息并參與腫瘤發展，可能是多種疾病非侵入性、敏感的潛在診斷標志物，特別是在惡性腫瘤領域[5-6]。miRNA-150是一種重要的造血細胞特異性miRNA，主要在B細胞、T 細胞和自然殺傷細胞中表達，在某些造血細胞系的分化過程中起著重要作用，特別是在淋巴細胞的發育過程中。研究表明，miRNA-150 在不同實體瘤中可作為致癌基因或抑癌基因發揮作用[7-8]。本研究探討NSCLC 患者的血漿miRNA-150水平與臨床特征和血清CEA 水平的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年5月至2022年5月西寧市第一人民醫院收治的NSCLC患者。納入標準：①經病理檢查確診為NSCLC；②接受手術切除治療；③年齡≥18歲；④臨床資料完整。排除標準：①合并心、腎、肺等重要臟器功能不全；②合并其他惡性腫瘤。依據納入和排除標準，本研究共納入96 例NSCLC 患者作為NSCLC 組，其中，男57 例，女39 例；年齡27～76 歲，平均（65.23±11.32）歲。另選取同期西寧市第一人民醫院收治的肺部良性疾病患者80 例作為對照組，其中男42 例，女38 例；年齡31～75 歲，平均（64.86±10.38）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集 分別收集兩組患者的肘靜脈血5 ml，分為兩份，分別置于枸櫞酸鈉抗凝管和未加抗凝劑的試管中。枸櫞酸鈉抗凝管中的樣本3000 r/min 離心10 min，留取血漿，于-80 ℃冰箱中保存。未加抗凝劑的試管，室溫靜置1 h，3500 r/min離心10 min，留取血清。

1.2.2 血漿miRNA-150 水平檢測 檢測時解凍血漿，按照德國Qiagen 公司的miRNeasy 試劑盒說明書提取血漿總RNA，使用UV-2800 紫外分光光度儀測定其濃度及純度。采用逆轉錄試劑盒通過逆轉錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），再進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。PCR 反應體系：SYBR 熒光染料混合液12.5 μl，逆轉錄產物2.5 μl，上游引物和下游引物各1.5 μl，ROX 校正染料Ⅱ0.05 μl，無RNA 酶水6.95 μl。PCR 條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環。以U6作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算miRNA-150 的相對表達量。miRNA-150 正向引物5'-GGGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6正向引物5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。重復測量3 次，取平均值。

1.2.3 血清CEA 水平檢測 取血清，采用電化學發光法檢測血清CEA 水平，試劑盒購自北京華科泰生物技術有限公司，具體操作根據試劑盒說明書進行。CEA 正常參考值：﹤5 μg/L。

1.3 觀察指標

比較NSCLC組和對照組患者的血漿miRNA-150和血清CEA 水平。比較不同臨床特征NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平。分析NSCLC 患者血漿miRNA-150 水平與血清CEA 水平的相關性。分析miRNA-150、CEA 單獨及聯合檢測對NSCLC 的診斷效能。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。NSCLC 患者血漿miRNA-150 水平與血清CEA 水平的相關性采用Pearson 相關分析。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miRNA-150、CEA 單獨及聯合檢測對NSCLC 的診斷效能，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿miRNA-150 和血清CEA 水平的比較

NSCLC 組患者的血漿miRNA-150 和血清CEA水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 兩組患者血漿miRNA-150 和血清CEA 水平的比較

表1 兩組患者血漿miRNA-150 和血清CEA 水平的比較

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2.2 不同臨床特征NSCLC 患者血漿miRNA-150水平的比較

不同性別、年齡、吸煙史、組織學類型、臨床分期、分化程度、腫瘤直徑NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征NSCLC 患者血漿miRNA-150 水平的比較

2.3 血漿miRNA-150水平與血清CEA水平的相關性

Pearson 相關分析結果顯示，NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平與血清CEA 水平呈正相關（r=0.726，P=0.016）。

2.4 miRNA-150、CEA單獨及聯合檢測對NSCLC的診斷效能

miRNA-150、CEA聯合檢測診斷NSCLC 的AUC、靈敏度及特異度分別為0.986、93.1%、100%，均高于miRNA-150、CEA 單獨檢測。（表3）

表3 miRNA-150、CEA 單獨及聯合檢測對NSCLC 的診斷效能

3 討論

NSCLC 是一種實體瘤，由于早期缺乏特異性癥狀，常在晚期確診，導致手術治療機會較少。探索早期診斷及治療NSCLC 的有效方式，是延長患者生存期、改善患者預后的關鍵。腫瘤標志物檢測具有經濟、有效、簡便及可重復性高等特點，但存在靈敏度低或特異度不足等問題，不能有效用于NSCLC 的早期診斷。

miRNA 是一種長度約22 個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶標mRNA 的3'-非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）序列特異性結合調節基因表達。miRNA 參與調控多種生物過程，包括細胞增殖、凋亡、分化和信號轉導。每一個miRNA都能靶向調控數百個mRNA，其表達水平的任何變化都可能對生物過程產生重大影響，導致病理生理改變。通過對各種人類惡性腫瘤和217 種哺乳動物的miRNA 進行系統分析，發現miRNA 譜具有驚人的信息量，反映了腫瘤的發展譜系和分化狀態。腫瘤微環境通過細胞外泌體高度參與腫瘤細胞的代謝重組，促進營養物質的完全利用，有利于脂質和谷氨酰胺的氧化磷酸化，損害了糖酵解，從而使微環境從正常狀態轉變為腫瘤有利狀態，為腫瘤生長、侵襲和耐藥提供了條件。越來越多的證據表明，外泌體miRNA 對改變肺癌微環境具有至關重要的作用，可能在NSCLC 細胞的免疫逃逸、化療藥物耐藥和生物學功能等方面發揮作用[9]。因此，miRNA 有可能作為一種有前景的非侵入性生物標志物和潛在靶標應用于NSCLC 的診斷和治療。研究表明，miRNA-148a 通過靶向WNT1 抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，并且miRNA-148a 低表達與NSCLC 的分化程度、淋巴結轉移情況和腫瘤相關死亡風險密切相關[10]。miRNA-4286 能夠通過靶向核輸出蛋白1 調節凋亡通路，從而降低NSCLC 細胞對順鉑的敏感性[11]。miRNA-300 可通過下調E26轉錄因子1（E26 transformation specific 1，ETS1）的表達抑制NSCLC 細胞增殖、遷移和侵襲，從而抑制NSCLC 的進展[12]。

miRNA-150 位于人類染色體19q13 上，其異常表達與惡性腫瘤的發生發展有關。研究表明，miRNA-150 在多種惡性腫瘤中具有促癌作用，miRNA-150 可通過與叉頭框蛋白O4（forkhead box O4，FOXO4）mRNA 的3'-UTR 結合，誘導FOXO4轉錄阻滯，促進宮頸癌細胞生存和細胞周期進展[6]。miRNA-150 以腫瘤融合抑制因子（suppressor of fused homolog，SUFU）為靶點，通過Hedgehog 和WNT 信號的雙重激活，促進胃癌細胞增殖、遷移和上皮-間充質轉化[7]。另有研究表明，miRNA-150 可能作為抑癌基因，通過下調黏蛋白4（mucin 4，MUC4）的表達阻斷人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）及其下游黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinas，ERK）信號通路，從而抑制胰腺癌細胞生長及惡性行為特性[13]。因此，miRNA-150 作為癌基因還是抑癌基因取決于腫瘤類型。

本研究結果顯示，NSCLC 組患者的血漿miRNA-150 水平明顯高于對照組，說明miRNA-150 在NSCLC 患者的血漿中呈高表達，可能在NSCLC 中發揮致癌基因的作用。本研究分析血漿miRNA-150 水平與NSCLC 患者臨床特征的關系，結果發現，不同性別、年齡、吸煙史、組織學類型、臨床分期、分化程度、腫瘤直徑NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），與既往研究報道的結果一致[14]。說明NSCLC 患者血漿miRNA-150 水平不受臨床特征影響。本研究的Pearson 相關性分析結果顯示，NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平與血清CEA水平呈正相關（P﹤0.05）。ROC 曲線顯示，miRNA-150 診斷NSCLC 的靈敏度、特異度分別為92.3%、90.9%。miRNA 即使在惡劣條件下，如煮沸、非常低或很高的pH 值和長時間儲存時，仍保持高度穩定，可以作為穩定的檢測指標。Salem 等[15]研究顯示，miRNA-150-5p 診斷子宮內膜癌的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為88.9%、100%、100%、78.9%。本研究中，CEA 診斷NSCLC 的靈敏度和特異度分別為84.6%、71.7%，與miRNA-150 聯合后靈敏度和特異度均提升，分別達到93.1%和100%。說明miRNA-150 與CEA 聯合檢測對NSCLC 的診斷效能較高。但鑒于本研究樣本量有限，且樣本來自同一醫院，結果可能存在偏倚，未來需加大樣本量進行多中心研究進一步驗證。

綜上所述，NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平較高，其與患者的臨床特征無關，但與血清CEA水平呈正相關，與CEA 聯合檢測可有效診斷NSCLC。