一種新型線粒體DNA深度測序方法的準(zhǔn)確性評估*

朱琳,林穎,朱玉青,黃明濤,梁棟,胡平,許爭峰,張軍(.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,南京 66;.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心,南京 0004)

線粒體攜帶一套母系遺傳的且獨立于核基因組的線粒體基因組(mtDNA)。由于mtDNA相較于核基因組更易突變[1],且以多拷貝的形式存在于線粒體基因組中,因此其突變往往具有異質(zhì)性,即突變型和野生型mtDNA共存[2]。針對異質(zhì)性變異,突變型mtDNA占mtDNA總量的比例被稱為異質(zhì)度,致病性變異的不同異質(zhì)度水平往往與線粒體疾病的臨床表型相關(guān)[3],因此高靈敏度、高特異性地檢測mtDNA變異,尤其是異質(zhì)性變異,在臨床和實驗研究中極為重要。在前期研究中,本課題組開發(fā)了一套基于線粒體分離純化的新型mtDNA深度測序方法,可實現(xiàn)PCR非依賴性的全線粒體基因組深度測序。然而,該方法針對人類外周血樣本的檢測性能尚未與目前主流的基于長片段PCR(lrPCR)的mtDNA深度測序方法相比較。為此,本研究旨在對10例孕婦外周血樣本采用兩種方法進行平行試驗,通過分析比較所得測序結(jié)果,評估新方法的可靠性。

1 材料和方法

1.1研究對象 選取2022年1月至8月于南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進行無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的10例孕婦,孕周16～18周,年齡26～37歲,中位年齡32歲。本研究經(jīng)南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號2021KY-130),所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2儀器及試劑 Lymphoprep淋巴細胞分離液、SepMate離心管(加拿大Stemcell公司),RSB裂解液[500 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH調(diào)至7.4),150 μL 3 mmol/L MgCl2,100 μL 10 mmol/L NaCl,加水定容至50 mL],NP40及RSB裂……