一種基于線粒體分離純化技術(shù)的新型線粒體DNA深度測(cè)序方法*

朱玉青,朱琳,黃明濤,胡平,沈彬,梁棟,許爭(zhēng)峰(.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心,南京 0004;.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 66)

線粒體是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)能量代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等重要功能的細(xì)胞器,擁有一套獨(dú)立于細(xì)胞核基因組的遺傳物質(zhì),即線粒體基因組(mtDNA)[1]。人線粒體基因組是1個(gè)長(zhǎng)度為16 569 bp的環(huán)狀雙鏈DNA分子,以多拷貝的形式存在于細(xì)胞中。mtDNA由于缺少DNA損傷修復(fù)系統(tǒng),故而較之細(xì)胞核基因組更易產(chǎn)生突變[2],并且mtDNA突變可通過(guò)母系遺傳的方式傳遞至子代中[3]。由于線粒體基因組上的致病性突變可導(dǎo)致多種嚴(yán)重的線粒體代謝相關(guān)遺傳性疾病[4],因此對(duì)全線粒體基因組的高通量測(cè)序在線粒體遺傳病的診斷和深入研究十分重要。但是,mtDNA突變往往具有異質(zhì)性[5],且在細(xì)胞核基因組中存在同源序列[6],上述特點(diǎn)給全線粒體基因組的特異性深度測(cè)序帶來(lái)了額外的困難。本研究旨在建立了一種基于線粒體分離技術(shù)的mtDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序方法,以期實(shí)現(xiàn)特異性針對(duì)線粒體基因組的深度測(cè)序。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑 Thermo ST16離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司),Microfuge 20R 4 ℃離心機(jī)(德國(guó)Beckman公司),ABI Veriti PCR儀(美國(guó)ABI公司),CELDOC XR凝膠圖像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司),Qubit 3.0熒光計(jì)(美國(guó)Invitrogen公司),A63880 AMPure XP磁珠(德國(guó)Beckman公司)。Lymphoprep淋巴細(xì)胞分離液、SepMate離心管(加拿大Stemcell公司),NP40裂解液、Tween-20(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),RSB裂解液[配制:500 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),100 μL 10 mmol/L NaCl,150 μL 3 mmol/L MgCl2,混勻后加ddH2O定容至50 mL],2×TD 緩沖液[配制:2 mL 20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6),1 mL 10 mmol/L MgCl2,20 mL mmol/L 20%二甲基甲酰胺(DMF),混勻后加ddH2O定容至100 mL],ExoV核酸外切酶(英國(guó)NEB公司),PCR擴(kuò)增試劑盒、Tn5轉(zhuǎn)座酶試劑盒、雙端測(cè)序標(biāo)簽(Index)文庫(kù)制備試劑盒(南京諾唯贊公司),DNA純化試劑盒(美國(guó)Zymo公司)。……