養殖池塘底泥中恩諾沙星對氮轉化的影響

2023-06-02 02:53:12劉立早張玉平張玲玲

西北農業學報 2023年5期

劉立早,張玉平,張玲玲

(上海市水產研究所,上海市水產技術推廣站,上海 200433)

氮作為水生生態系統的重要營養元素,是其中新陳代謝的關鍵元素之一[1]。由于底泥是水生生態系統中氮的重要源和匯[2],所以現有的氮素在底泥-間隙水-上覆水之間的遷移轉化研究中,多以大湖、海灣作為研究對象,較少涉及水產養殖池塘這種淺水塘的底泥氮轉化研究。水產養殖池塘底泥中氮含量過高,會引起池塘水中氨氮含量升高,從而可能對養殖生物的生長構成威脅[3]。微生物在氮轉化過程中起到重要作用,如厭氧氨氧化細菌、硝化細菌和反硝化細菌等,微生物的硝化、反硝化作用已被證實是池塘底泥中氮轉化的主要機制[4]。

為減少水產養殖生物生病,提高養殖經濟效益,抗生素在養殖過程中被大量甚至過度使用[5],過量使用的抗生素最終會沉降并吸附在底泥中。恩諾沙星(ENR)屬于最常用的氟喹諾酮類抗生素,在水產養殖過程中被廣泛使用。對珠江口水產養殖區的調查顯示,在4大類抗生素中,氟喹諾酮類抗生素的殘留濃度和檢出率最高,在底泥檢出率高于80%,其中又以ENR占比最高[6]。殘留于水產養殖池塘底泥中的ENR可能會抑制氮轉化功能微生物的生長,從而影響水產養殖環境中的氮轉化過程。研究表明,在用木屑生物反應器處理污水時,ENR 會對污水中的反硝化作用產生階段性抑制作用[7]。在用厭氧氨氧化工藝處理養豬廢水時,廢水里的 ENR 短期和長期作用均會對厭氧氨氧化細菌產生抑制作用,且抑制作用的強弱與其濃度有關[8]。目前,ENR影響氮轉化微生物方面的研究主要集中在可調控的污水處理裝置中,而在有機質含量高且厭氧的養殖池塘底泥中,ENR影響氮形態轉化方面的研究還比較缺乏。因此,殘留于池塘底泥中的 ENR 引起研究者高度重視,可能對底泥中的氮轉化過程及功能微生物產生影響。

本研究采用室內靜態模擬的方法,在池塘底泥中添加不同含量的ENR,通過分析池塘底泥和間隙水中的氮形態變化,及底泥中氮轉化基因的絕對含量變化,探討水產養殖池塘底泥中不同含量ENR殘留對氮轉化過程的影響。

1 材料與方法

1.1 研究方法

試驗設置1 個對照組和3 個處理組,每個試驗組3個平行,編號為對照組、T1、T2和T3,3 個處理組分別添加恩諾沙星(ENR),檢測含量分別為(1.29±0.15)、(2.06±0.27)、(4.13±0.64)mg/kg,在每個柱子底泥中間高度位置水平放置間隙水采樣器,水箱加水至水深60 cm,如圖1所示。試驗在溫室大棚中進行,透光性良好,避免降雨對試驗造成的影響,試驗周期為2021年4月27日至6月30日,水溫為19.9 ℃～32.3 ℃。

①液面;②間隙水采樣器;③底泥

1.2 樣品分析

底泥樣品中氮轉化功能基因含量通過熒光定量PCR分析,由上海美吉生物醫藥科技有限公司(上海,中國)檢測完成。稱取0.5 g底泥樣品,提取底泥氮轉化DNA。用Nano-Drop核酸蛋白儀(NanoDropOne,Thermo,美國)和10 g/L的瓊脂電泳測定DNA質量,將通過質量檢測的DNA樣品于-20 ℃冰箱保存,備用。測定的16S rRNA功能基因片段包括Bacterial、Archaeal、anammox、amoA、nxrA、narG、nirK、nirS、nosZ。所用儀器為熒光定量PCR儀(ABI 7300,Applied Biosystems,美國),擴增效率為89%～110%,且R2>0.99時默認數據合格,氮轉化功基因引物序列信息見表1。

表1 氮轉化功能基因引物序列信息Table 1 Primers for nitrogen transformation genes

1.3 數據統計分析

試驗數據均使用Excel 2016處理,采用SPSS statistics 19.0對數據進行統計分析和方差分析(LSD,P<0.05),圖表使用origin 8.0制作。

2 結果與分析

2.1 底泥中不同形態氮含量變化

處理前底泥中4 種形態氮分布特征如圖2所示,含量大小表現為SAEF-N(39.57%)>IEF-N(35.35%)>SOEF-N(18.30%)>WAEF-N (7.13%)。處理前IEF-N含量為(164.42± 21.52)mg/kg,占TF-N比例為34.84%,處理后降至(49.24±4.51)～(62.21±8.04)mg/kg,占比降為14.78～21.48%。IEF-N屬于不穩定氮,很容易進入水體中[11]。試驗中底泥完全被上覆水覆蓋,在處理過程中較易與上覆水發生交換,這可能是導致IEF-N明顯降低的原因[12]。

圖2 底泥中4 種提取態氮含量Fig.2 Four forms of extractable nitrogen in sediment

圖3 不同濃度恩諾沙星下底泥中三態氮含量Fig.3 Content of three forms of nitrogen in sediment under different ENR concentrations

圖4 恩諾沙星影響底泥中硝化功能基因含量Fig.4 Absolute abundance of nitrification functional genes in sediment under effects of ENR

WAEF-N是TF-N中含量最低的氮形態。處理前WAEF-N含量為(33.25±8.80)mg/kg,占TF-N比例為7.27%,處理后的WAEF-N含量為(34.82±8.37)～(54.33±16.70)mg/kg,占TF-N比例上升到11.26～15.51%。WAEF-N含量主要與底泥中的碳酸鹽環境有關。本試驗中除了對間隙水采樣以外,基本沒有對底泥擾動,碳酸鹽環境較為穩定。

SAEF-N易從還原態底泥中釋放[13]。由圖2可知,處理前的SAEF-N含量均值為(182.07±14.58)mg/kg,是TF-N中最主要的賦存形態,占比達39.80%。經過處理之后,各組SAEF-N含量下降為(83.82±13.21)～(108.42±22.25)mg/kg,占TF-N的比例下降為26.93%～ 32.59%,其中T2、T3處理組的下降最為明顯。SAEF-N的形成和分布主要由底泥的氧化還原環境控制[14],一般認為還原環境則會促進SAEF-N釋放活動。由于本研究中底泥均處于較強的還原環境,有利于SAEF-N向水體釋放。而T2、T3處理組中SAEF-N下降較多可能是因為更為強烈的反硝化作用,反映在反硝化基因中T2和T3的反硝化基因豐度更高(圖5)。

圖5 底泥中反硝化功能基因絕對豐度Fig.5 Absolute abundance of denitrification functional genes in sediment

SOEF-N處理前含量為(84.20±7.77) mg/kg,占TF-N的比例為18.30%。處理后SOEF-N含量為(101.77±23.48)～(137.83± 4.46)mg/kg,SOEF-N變為占比最高的氮形態,上升為34.85%～43.43%。SOEF-N是有機形態氮,釋放能力最弱,一般只有在氧氣和好氧微生物存在的情況下才會釋放,是最難參與氮循環的形態[15]。

2.2 恩諾沙星對底泥中氮轉化功能微生物的影響

2.2.1 細菌及古菌豐度底泥中細菌(bacterial)絕對豐度從處理前(7.07×109)copies/g減少為處理后(3.68×109～6.95×109)copies/g,各處理組均有所下降,但差異并不顯著(P>0.05)。而底泥中古菌(archaeal)的絕對豐度則比bacterial低兩個數量級,從處理前(7.21×107)copies/g變為處理后(4.36×107～7.54×107)copies/g,其中T3明顯低于其余各處理組(P<0.05),可能較高的ENR含量對古菌(archaeal)有抑制作用。有研究表明,盡管古菌在微生物群落中的豐度不高,但是在氮的轉化過程中起著重要作用[17]。

2.2.2 底泥中氨氧化細菌及硝化細菌 7種氮轉化功能基因在底泥中的背景豐度為1.05×109copies/g,ENR處理后對照組、T1、T2和T3底泥中氮轉化相關功能基因的絕對豐度分別為 8.71×108、6.14×108、9.66×108和7.65×108copies/g,各處理組間未見明顯差異(P>0.05)。其中anammox基因是相對豐度最高的,占比達 60.0%～78.4%。可見厭氧氨氧化作用是底泥中微生物轉化氮的主要途徑。